菌虫复合技术在梨火疫病疫木生物转化中的应用

林果疫木枝条的无害化处理和资源化利用,是当前农林废弃物处理以及植物疫病防控的难点,也是农业环境科学与植物保护科学交叉研究的新方向。本试验以库尔勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yu)梨火疫病疫木为靶标,采用菌-虫(白星花金龟,Protaetia brevitarsis)联合,开展菌剂、牛粪香梨枝条配比、酵化时间的三因素五水平正交试验,明确疫木发酵关键技术参数,以及白星花金龟最佳取食组合。试验结果表明,5种腐解菌+牛粪处理最高发酵温度均已超过55℃,其中EM菌剂腐解效果最好,LK菌剂次之。发酵产物经菌虫复合转化12 d后,幼虫质量增加5.32~8.38 g,虫砂量可达36.93~83.55 g,虫砂转化率最高可达94.26%。综合考虑降低牛粪添加比例、酵化时间及物料处理成本,LK菌剂、添加40%的牛粪及酵化25 d为白星花金龟幼虫最佳取食组合方案,且发酵产物以及白星花金龟转化产物虫体和虫砂中均未检测出梨火疫病菌(Erwinia amylovora)。研究表明,微生物与白星花金龟相结合对香梨疫木枝条有较好的转化率,通过白星花金龟实现了疫木枝条的资源化利用,且阻断了疫木枝条传播病源的途径。

梨火疫病菌在库尔勒香梨枝条中的侵染定殖和扩展特征研究

【目的】示踪梨火疫病菌Erwinia amylovora在库尔勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yu)(简称香梨)枝条组织中侵染定殖和扩展特征,为梨火疫病的有效防治提供依据。【方法】以分离获得梨火疫病强致病力菌株E.a001为材料,采用热激法将携带有绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)质粒phc60-gfp转化E.a001,获得了能发出强烈绿色荧光的标记菌株E.a001-gfp。利用该标记菌株接种香梨枝条,检测、观察其在香梨枝条组织中的侵染定殖和扩展动态。【结果】针刺接种和喷雾接种E.a001-gfp引起枝条发病的最低浓度分别为106cfu·mL^(-1)和107cfu·mL^(-1)。相同浓度的病原菌接种,喷雾接种较针刺接种后发病显症时间延迟2~3 d。梨火疫病菌侵染枝条产生的坏死病斑的扩展速率随病原菌浓度提高而升高;病菌在1年生枝条上的生长扩展速度显著快于在2年生枝条内的扩展速度。梨火疫病菌入侵后主要存在于枝条维管系统中,大量分布于皮层薄壁细胞和韧皮部薄壁细胞间隙,少量存在于木质部导管中。在香梨发病枝条上,病健交界处的活菌数量最高,可达到108cfu·g^(-1),未显症部位0~10 cm处病原菌为105cfu·g^(-1),但在香梨枝条病斑外未显症部位10~15 cm处均未分离出病原菌。【结论】研究明确了梨火疫病菌在香梨枝条组织中的扩展距离、迁移时间及速率,以及分布及定殖量,为病枝的准确修剪和制定病害的综合防控措施提供了科学依据。

基于HS-SPME-GC-MS方法的不同倍性库尔勒香梨果实风味相关代谢物质的变化

以普通二倍体库尔勒香梨及其自然发生的三倍体为试验材料,利用顶空固相微萃取法(HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS),对果皮和果肉中的挥发性成分及果肉中的初生代谢物质进行评价,并分析比较其种类和含量上的差异。对挥发性物质代谢谱的分析显示,与普通库尔勒香梨相比,三倍体库尔勒香梨果皮中挥发性物质总含量增加33%,但种类减少,主要挥发性物质中醛类总比例从69.74%升高到74.40%;在果肉中,挥发性物质含量无显著变化,但种类增加了9种。初生代谢产物对比结果显示,二倍体与三倍体香梨的蔗糖和果糖含量相对稳定,但三倍体中D-(-)-呋喃果糖、D-果糖、D-(-)-果糖和蔗糖的占比分别升高了4.62%、1.59%、1.28%和0.68%;苹果酸、奎宁酸、柠檬酸含量均低于二倍体库尔勒香梨且游离氨基酸减少了4种。因此,三倍体香梨果皮中挥发性物质及初生代谢物质代谢谱都发生了较大变化,可导致香味品质发生变化。

库尔勒香梨挥发性物质及初生代谢物的GC-MS分析

分别采用甲基叔丁基醚(MTBE)萃取法和顶空固相微萃取(HS-SPME)法提取成熟期(盛花后180 d)库尔勒香梨果实的挥发性物质,结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对挥发性物质进行定性和定量分析,在筛选适宜的挥发性物质提取方法的基础上,比较果实不同组织挥发性物质的组成差异。结果表明:相较于MTBE萃取,HS-SPME对库尔勒香梨挥发性物质有更好的萃取效果。MTBE-GC-MS法在库尔勒香梨中共检测到15种挥发性物质,未检测到酯类、芳烃及酮类物质;HS-SPME-GC-MS法共检测到98种化合物,主要为醛类、酯类、醇类以及萜烯类,(E)-2-己烯醛、己醛、α-法尼烯、1-壬醇、乙酸己酯是其主要挥发性物质;果皮比果肉含有更丰富的挥发性物质,32种物质为果皮所特有。进一步利用GC-MS对果肉中初生代谢物质进行分析,共检测到果糖、葡萄糖、山梨醇等共17种糖以及苹果酸等共8种酸,糖酸比为71.49。

库尔勒香梨叶片不定芽再生诱导的研究

以库尔勒香梨幼叶为外植体,研究基本培养基种类、外源激素浓度、AgNO3浓度及接种叶片的放置方向对叶片不定芽再生的影响。结果表明:培养基的种类是影响叶片能否获得再生不定梢成功的关键,NN69培养基是香梨叶片再生不定芽的最佳培养基,诱导不定芽的分化以培养基NN69+TDZ 1.0mg/L+IBA 0.3mg/L为最佳;附加0.5mg/L AgNO3有利于叶片再生;以叶片远轴面接触培养基比近轴面接触培养基更利于不定芽的再生;结合21d暗培养香梨叶片再生频率最高可达到64.3%,再生芽数最高为2.59。

库尔勒香梨PsLOX基因克隆及生物信息学分析

克隆了库尔勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yü)脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)基因PsLOX,了解其在香梨果实不同发育时期的表达差异,为香梨果实香气代谢机理研究提供理论依据。以库尔勒香梨嫩叶及不同时期果实表皮为试材,利用两种不同的方法提取总RNA,通过RT-PCR技术得到目的基因Ps LOX的cDNA序列,以生物信息学方法对其进行分析和功能预测。运用半定量RT-PCR(SqRT-PCR)技术,分析PsLOX基因在香梨嫩叶及果实生长发育及货架期的表达特性和差异。结果:试剂盒提取总RNA质量较高,PsLOX基因CDS序列为912 bp,编码303个氨基酸,属于脂氧合酶家族基因,与其他植物LOX基因编码的氨基酸序列有较高的同源性,与南果梨相似性最高,达到99%;PsLOX基因在香梨果实中发育过程中表达差异明显,即生长发育前期表达量很低,成熟至完熟时期表达量最高,然后开始减少。推测克隆获得PsLOX基因在香梨果实香气代谢过程中起到重要作用。