Kozak序列+4G提高绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达

构建含不同Kozak序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因真核表达载体,并检测它们在HEK293细胞中的表达差异。通过设计突变的PCR引物改变目的基因GFP的Kozak序列,+4位碱基分别为A和G,且不改变氨基酸编码,将PCR扩增的GFP片段与载体pcDNA3.1进行酶切、连接、转化、鉴定。成功构建的pHGFP-A,pHGFP-G质粒采用脂质体法转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光表达,流式细胞术检测目的蛋白GFP的荧光表达阳性率,Western blot检测目的蛋白GFP的表达。构建的两质粒均能有效转染HEK293细胞,其中流式细胞术分析显示:pHGFP-A组GFP阳性率约为15%,pHGFP-G组GFP阳性率约为45%;Western blot显示pHGFP-G的GFP表达量约为pHGFP-A的GFP表达量3.87倍。结果表明,Kozak序列+4G(-3位为嘌呤碱基时)在蛋白表达中发挥重要作用,可以使绿色荧光蛋白GFP在HEK293细胞中的表达量提高约4倍。

细胞周期蛋白D1重组质粒的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的克隆人细胞周期蛋白D1基因,构建真核表达载体,诱导并鉴定其表达。方法利用RT-PCR法,以低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞mRNA为模板,扩增周期蛋白D1基因,构建重组表达载体pIRES2-EGFP-D1和pEGFP-C2-D1,用脂质体LipofectamineTM 2000将重组质粒转染到低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞,诱导其表达,免疫荧光、Western blotting等鉴定其表达。结果电泳获得918bp预期片段,重组质粒经酶切、PCR和测序分析证实含有周期蛋白D1完整读码框,将重组质粒导入CNE-2Z细胞并成功表达,目的蛋白经免疫荧光和Western blotting鉴定具有生物学活性。结论成功克隆并构建含周期蛋白D1基因的真核表达GFP质粒,为进一步研究周期蛋白D1在鼻咽癌CNE-2Z细胞中的作用奠定基础。

重组真核质粒pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)的构建及表达

目的:将人类G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain binding protein)蛋白Domain(1～5)基因片段分别定向连入pEGFP-C2质粒,使G3BP蛋白各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pEGFP-C2载体上,再将构建成功的pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)重组质粒转染入HeLa细胞内,以荧光显微镜及Western印迹法检测绿色荧光蛋白与目的蛋白的融合表达情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到绿色融合蛋白的表达。结论:重组pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)质粒成功构建并表达。

组织蛋白酶B-RNAi-LV载体构建及其对小鼠脑微血管内皮细胞系bEND.3的影响

目的构建组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)小RNA(siRNA)慢病毒载体,并探讨其对小鼠脑微血管内皮细胞(bEND.3)的影响。方法设计并合成含有干扰Cathesin B基因的19 nt的双链寡DNA片段,将此片段克隆到携有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体质粒pGCSIL-GFP上,经测序正确后,命名为pGCSIL-GFP-CTSB,将慢病毒表达载体pGCSIL-GFP-CTSB、慢病毒包装载体pHelper1.0和pHelper2.0 3质粒共同转染于293T细胞,获得携带Cathepsin B基因的RNAi慢病毒(Cathesin B-RNAi-Lentivirus,即CTSB-RNAi-LV),通过Real time-PCR和Western blotting方法观察CTSB-RNAi-LV对bEND.3的影响。结果 1.pGCSIL-GFP-CTSB中携带有正确的Cathesin B siRNA基因;2.目的基因Cathepsin B siRNA被RNAi慢病毒高效地转导入靶细胞bEND.3内,并达到稳定的表达;3.CTSB-RNAi-LV能有效降低bEND.3中Cathepsin B mRNA和蛋白表达。结论成功构建了RNAi慢病毒载体pGCSIL-GFP-CTSB;并成功包装了RNAi慢病毒CTSB-RNAi-LV;CTSB-RNAi-LV能有效地抑制bEND.3中Cathepsin B mRNA和蛋白表达水平下调。

增强型绿色荧光蛋白原核表达纯化与多克隆抗体的制备

目的 :进行增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的克隆、原核表达和纯化以及多克隆抗体的制备 ,为以后纯化EGFP融合蛋白奠定基础。方法 :构建pGEX 4T3 EGFP重组质粒 ,在大肠杆菌BL2 1中进行原核表达 ,用亲和层析法纯化GST EGFP ,免疫BAB/C小鼠制备EGFP多克隆抗体。结果 :①目的蛋白GST EGFP表达量为 8g/L。②获得纯抗体溶液 5ml,浓度为 0 .4g/L。③EGFP抗体在 1 10 0 0 0 0稀释度时 ,Westernblot检测条带清晰 ,背景干净。结论 :通过优化诱导条件 ,利用大肠杆菌可低成本获得大量GST EGFP。直接使用GST EGFP融合蛋白免疫BAB/C小鼠 。

真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG的构建及在HeLa细胞中的表达

为了将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)引入细胞核内,采用两轮PCR方法从原先克隆在pcD-NA3.1(-)+GFP载体中将GFP编码序列扩增出来并引入Kozak序列和核定位信号,使用常规酶切和连接方法将其重组至pUCm-T克隆载体中,再将目的片段重组至pcDNA3.1(-)中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定后,构建了带有Kozak序列和核定位信号的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG。真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG被转染试剂Su-perfect转染至HeLa细胞中,绿色荧光蛋白基因在HeLa细胞中得到表达而且在细胞核中观察到绿色荧光。该研究以绿色荧光蛋白为标记初步建立了活体观察真核细胞核动态变化的研究体系。

绿色荧光蛋白的原核表达和纯化及鉴定的实验设计与实践

该文以绿色荧光蛋白FRP为实验对象,通过设计原核蛋白表达、镍柱亲和纯化、荧光光谱分析、SDSPAGE电泳分离、Western blotting免疫印迹及蛋白质质谱鉴定等内容的生物化学综合实验,提高学生的生物化学实验技能。荧光光谱分析表明,纯化的GFP蛋白的最大激发波长为480nm,最大发射波长为500nm,与已知的GFP荧光光谱基本相同。SDS-PAGE电泳分离发现,GFP的亲和纯化效果好,且纯化得到的GFP分子量约为27kDa,与理论值相符。该实验适用于生物科学专业本科生系统完整地学习蛋白质表达、纯化和鉴定的实验方法,具有很好的综合性,取得非常好的教学效果。

hPlk2基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人Polo样激酶2(hPlk2)真核表达载体并证实该融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPlk2基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。最后利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hPlk2在COS-7细胞内的定位。结果:hPlk2基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小为2 058 bp,并测序成功。Western blot检测到了pEGFP-hPlk2融合蛋白表达,分子量约为105 kDa。pEGFP-hPlk2在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。结论:成功构建了hPlk2基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPlk2蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。

人成釉蛋白基因在COS-7细胞中的表达

目的:通过构建真核表达载体,在COS-7细胞中表达人成釉蛋白基因。方法:分别将人成釉蛋白基因克隆入非融合和融合真核表达载体pcDNA 3.1和pEGFP-C3中,证实克隆正确后,用脂质体介导将载体转染哺乳动物细胞COS-7,通过免疫组织化学、W estern B lot等方法检测成釉蛋白在哺乳动物细胞中的表达。结果:表达的绿色荧光蛋白融合蛋白所发出的荧光位于细胞浆中,胞核中无荧光,与免疫组化结果一致,说明人成釉蛋白位于细胞浆中。W estern B lot检测显示在COS-7细胞中表达的成釉蛋白的分子量为65×103,分泌至培养基中的成釉蛋白的分子量为62×103。结论:成功在哺乳动物细胞中表达了人成釉蛋白,为研究成釉蛋白合成后的修饰加工和成釉蛋白的结构,为今后进一步研究成釉蛋白结构和功能的关系奠定了基础。

家蚕Ssu72蛋白基因的克隆及序列与表达分析

Ssu72(suppressor of sua7-1 clone 2)蛋白的命名源于对酵母sua7-1基因突变的抑制作用,推测其在真核生物RNA聚合酶Ⅱ作用的转录过程中有重要功能。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到家蚕Ssu72蛋白基因(BmSsu72)的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该基因ORF为579 bp,编码蛋白质含有192个氨基酸残基,具有完整的Ssu72保守结构域,三级结构包含9个α螺旋和4个β折叠,推测α螺旋和β折叠之间可能形成锌指结构。以家蚕蛹cDNA为模板PCR克隆到BmSsu72基因的完整ORF序列,通过构建载体pET-28a(+)-BmSsu72在大肠杆菌中表达并纯化了重组BmSsu72蛋白,进而利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。采用荧光定量PCR检测到BmSsu72基因随着家蚕的生长发育转录水平呈逐渐下降趋势,在卵期的转录水平最高,在蛾期的转录水平最低;该基因在5龄幼虫各组织中的转录水平以马氏管最高,卵巢和丝腺次之。Western blotting检测BmSsu72在家蚕5龄幼虫各个组织中均有表达,其中在丝腺中的表达水平最高。推测BmSsu72可能与家蚕丝腺的分泌相关。

家蚕核型多角体病毒gp41基因的融合表达及功能鉴定

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。

hβ-arrestin2基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

目的:构建p EGFP-C1-β-arrestin2融合蛋白表达载体,并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:以p GEX-5X-1-β-arrestin2为模板,PCR法扩增hβ-arrestin2编码序列,亚克隆至p EGFP-C1中,p EGFP-C1-β-arrestin2经双酶切初步鉴定再送测序公司检测正确后瞬时转染人胚肾细胞HEK293,Western blot检测融合蛋白表达。激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白在HEK293细胞中的分布。结果:hβ-arrestin2编码序列被成功克隆至p EGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为77k Da,p EGFP-C1-β-arrestin2定位于HEK293细胞的细胞质中。结论:成功构建hβ-arrestin2基因真核表达载体,证实了融合蛋白定位在HEK293的细胞质中。