KpsF基因对烟曲霉生长的影响以及抗真菌药物作用下的生长变化

目的KpsF基因在烟曲霉生长中的作用目前还未明确。文中旨在构建烟曲霉KpsF基因荧光定位菌株和过表达菌株,明确该基因对烟曲霉生长和在抗真菌药物作用下的生长变化情况。方法构建烟曲霉KpsF基因敲除株(ΔKpsF)、KpsF过表达菌株。光学显微镜观察菌落特征,利用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光在烟曲霉生长中的定位变化;采用斑点法观察菌株在抗真菌药物作用下生长变化情况。结果同Ku80和△KpsF相比,烟曲霉KpsF基因过表达株菌落直径显著缩小(P<0.05)。低倍显微镜下观察可见:△KpsF和Ku80菌丝细长,排列整齐,舒展,菌丝分支角度多为45°;而KpsF过表达菌株菌丝生长较致密,分枝繁多,且菌丝短小,分支角度相对较大。高倍显微镜下观察可见:△KpsF和Ku80的分生孢子头规整,呈短柱状,梗壁光滑;KpsF过表达菌株分生孢子头明显发育不良,孢子头欠饱满,顶囊单层小梗不清晰。激光共聚焦显微镜观察示烟曲霉孢子状态下绿色荧光弥漫分布于整个细胞中,而在菌丝状态下可见荧光在隔膜处有明显聚集。KpsF过表达株菌菌落直径分别和卡泊芬净、伊曲康唑、两性霉素B浓度呈负相关(r=-0.568、-0.743、-0.813,P<0.05)。卡泊芬净浓度>1.0μg/mL时,△KpsF、Ku80菌株菌落直径分别和卡泊芬净浓度呈正相关(r=0.927、0.915,P<0.05),卡泊芬净浓度<1.0μg/mL时,△KpsF、Ku80菌株菌落直径分别和卡泊芬净浓度呈负相关(r=-0.929、-0.923,P<0.05)。△KpsF、Ku80菌株菌落直径同伊曲康唑、两性霉素B浓度均呈负相关(P<0.05)。结论烟曲霉KpsF基因过表达会影响烟曲霉的生长,且该基因可能参与烟曲霉生长形成分隔过程。KpsF基因缺陷在含卡泊芬净培养基上存在矛盾生长现象,过表达菌株无此现象。

含PxIxIT模序烟曲霉KpsF基因作用初探

目的构建烟曲霉KpsF基因缺陷株,初步了解KpsF基因在烟曲霉生长及与钙调磷酸酶相互作用关系。方法PCR扩增烟曲霉KpsF基因及其上、下游各约1.0kb的DNA片段,以pyrG为筛选标记,原生质体法构建KpsF基因缺陷株ΔKpsF;观察ΔKpsF一般生长状况;实时荧光定量PCR方法检测Ku80(对照组)和ΔKpsF(实验组)在含有不同浓度CaCl_2的液体GMM培养基中钙调磷酸酶催化亚基(CnaA)相对表达水平。结果烟曲霉ΔKpsF和Ku80径向生长差异无统计学意义(P>0.05);表型未见明显差别;ΔKpsF在10mmol/L CaCl_2GMM液体培养基的CnaA相对表达量显著高于对照组Ku80(P<0.01),而100mmol/L CaCl_2的CnaA相对表达量却没有明显变化(P>0.05)。结论 KpsF基因缺陷对烟曲霉的径向和表型生长没有明显影响,对CnaA表达量的影响与Ca^(2+)浓度有关。在低浓度Ca^(2+)条件下,KpsF可能参与对钙调磷酸酶的负反馈调节作用,而在高浓度的Ca^(2+)条件下,这种负反馈调节作用受到抑制。