Krüppel样因子6抑制人晶状体上皮细胞增生的研究

背景 研究表明,Kruppel样因子6（KLF6）与生长发育、细胞分化、增生、凋亡、血管生成及组织修复等生理或病理过程有关.在眼科领域,关于人晶状体上皮细胞（LECs）中KLF6蛋白表达水平及KLF6对LECs增生的影响报道较少. 目的 探讨KLF6对LECs株（HLE-B3）增生的抑制作用. 方法 首先用逆转录PCR（RT-PCR）法构建真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6,并用双酶切法和PCR法对表达质粒进行鉴定.用含体积分数10％胎牛血清的低糖DMEM对HLE-B3进行培养和传代,按照干预方法的不同将培养的HLE-B3分成4个组,各组均给予KLE-B3转染试剂,空白对照组不加入任何外源质粒及胰岛素样生长因子-1（IGF-1）;单纯IGF-1刺激组仅给予IGF-1刺激;空质粒转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2质粒空载体,同时给予IGF-1刺激;pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒,且给予IGF-1刺激.细胞干预24 h后,采用水溶性四唑盐-1（WST-1）实验检测各组细胞的吸光度（A450）值;采用Western blot法测定各组细胞中KLF6蛋白的表达水平.以1＆#215;104个/片的密度将HLE-B3细胞爬片培养24 h,并分别将0、0.10、0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染到各组铺片细胞中,用终质量浓度为50 μg/L的IGF-1刺激24 h,然后应用免疫细胞化学技术检测各组细胞中Ki-67蛋白的相对表达量;采用荧光半定量PCR法检测各组细胞中Ki-67 mRNA的表达变化.结果 扩增得到的PCR产物反应条带与KLF-6基因长度相符,PCR和EcoR I、Sal I限制性内切酶双酶切法鉴定条带大小与预期相符,成功构建pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒.WST-1实验显示空白对照组、单纯IGF-1刺激组、空质粒转染＋IGF-1组和pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组细胞A值分别为0.86±0.00、2.10±0.01、2.24±0.12和1.06±0.02,4个组间差异有统计学意义（F=38.322,P＜0.05）,其中pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组A值明显低于单纯IGF-1刺激组和空质粒转染＋IGF-1组,差异均有统计学意义（q=6.42、7.31,P＜0.05）.Western blot法检测显示,4个组间细胞中KLF6蛋白相对表达量的差异有统计学意义（F=591.858,P＜0.05）,pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组KLF6蛋白相对表达量分别是空白对照组、单纯IGF-1刺激组和空质粒转染＋IGF-1组的1.47、2.04、3.27倍.Ki-67蛋白在pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组细胞中的表达强度随质粒转染剂量的增加而逐渐减弱,0.10 μg和0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染后细胞中Ki-67 mRNA相对表达值分别为0.15±0.08和0.11±0.03,明显低于0μg pEGFP-C2-KLF6转染的细胞0.77±0.12,组间的总体差异有统计学意义（F=54.825,P＜0.05）. 结论 KLF-6能够抑制IGF-1诱导的HLE-B3的增生,是HLE-B3细胞增生的调控因子.

微小RNA⁃204⁃3p通过靶向调控Krüppel样因子6对高糖诱导小鼠足细胞损伤的保护作用

目的探讨微小RNA⁃204⁃3p(miR⁃204⁃3p)对高糖诱导小鼠足细胞MPC5损伤的保护作用及其分子机制。方法采用高糖(30 mmol/L D⁃葡萄糖)处理MPC5细胞。实时定量PCR(qPCR)检测细胞中miR⁃204⁃3p与锌指蛋白Krüppel样因子6(KLF6)mRNA水平。MPC5细胞分为NG组(正常对照),HG组(高糖刺激),HG+miR⁃204⁃3p组、HG+miR⁃NC组、HG+si⁃KLF6组、HG+si⁃NC组,HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA⁃KLF6组和HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA组。蛋白质印迹法(Western Blot)检测肌动蛋白微丝偶联蛋白(synaptopodin)、结蛋白(desmin)、B细胞淋巴瘤/白血病⁃2(Bcl⁃2)、Bcl⁃2相关X蛋白(Bax)与活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved⁃caspase⁃3)蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡,生物学信息预测和双荧光素酶报告基因分析miR⁃204⁃3p和KLF6的靶向关系。结果与正常对照相比,高糖可显著降低MPC5细胞中miR⁃204⁃3p表达量[(0.41±0.04)比(1.02±0.08)],上调KLF6 mRNA[(2.86±0.27)比(1.03±0.08)]和蛋白[(0.89±0.08)比(0.46±0.04)]水平,还可上调KLF6、desmin[(0.81±0.07)比(0.34±0.03)]、Bax、cleaved⁃caspase⁃3蛋白表达及细胞凋亡率[(22.46±2.08)%比(5.26±0.64)%],下调synaptopodin蛋白[(0.34±0.03)比(0.76±0.07)]及Bcl⁃2蛋白表达量(P<0.05)。与HG+miR⁃NC组比较,HG+miR⁃204⁃3p组明显提高synaptopodin[(0.67±0.06)比(0.32±0.03)]及Bcl⁃2蛋白水平,降低desmin[(0.41±0.04)比(0.83±0.08)]、Bax、cleaved⁃caspase⁃3蛋白水平及细胞凋亡率[(11.25±1.65)%比(24.58±2.47)%](P<0.05)。与HG+si⁃NC组比较,HG+si⁃KLF6组明显提高synaptopodin[(0.62±0.06)比(0.28±0.03)]及Bcl⁃2蛋白水平,降低desmin[(0.49±0.05)比(0.86±0.08)]、Bax蛋白水平及细胞凋亡率[(14.69±1.87)%比(25.47±2.68)%](P<0.05)。miR⁃204⁃3p直接靶向KLF6。与HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA组比较,HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA⁃KLF6组显著增加高糖刺激小鼠肾脏足MPC5细胞中KLF6、desmin[(0.68±0.06)比(0.36±0.04)]、Bax蛋白表达量和细胞凋亡率[(18.41±1.67)%比(11.05±1.02)%],显著减少synaptopodin蛋白[(0.38±0.03)比(0.69±0.07)]和Bcl⁃2蛋白表达量(P<0.05)。结论miR⁃204⁃3p通过直接靶向KLF6抑制高糖刺激的足细胞凋亡,保护细胞损伤。

高表达Krüppel样因子6对紫外线B诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的探讨Krüppel样因子6(KLF6)高表达对于紫外线B(UVB)诱导晶状体上皮细胞(HLECs)凋亡的影响。方法利用脂质体转染的方法将已成功构建的真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6转染到HLECs中,采用Westernblot法测定细胞中KLF6蛋白的表达水平;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染后细胞活力;经苏木精-伊红染色法观察细胞形态;采用Live/Dead染色法观察细胞受损情况;采用Westernblot法检测细胞中凋亡标志物bax和bcl-2的相对表达量,并计算bax/bcl-2比值;采用细胞凋亡检测试剂盒定量测定细胞凋亡水平,并检测细胞中活性氧簇(ROS)的表达水平。结果0.5μg转染组和1.0μg转染组细胞生存力较空载体对照组下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。KLF6高表达组细胞稀疏,细胞形态狭长,细胞质浓缩。正常对照组细胞形态稳定,数量均匀,为绿色活细胞;KLF6高表达组红色死亡细胞数量显著增多。UVB照射后,KLF6高表达组HLECs细胞凋亡值、bax相对表达量、bax/bcl-2比值、ROS表达量均高于空载体对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论高表达的KLF6通过调控凋亡相关蛋白的表达及促进内质网内ROS堆积来加剧UVB照射导致的HLECs凋亡,提示KLF6参与HLECs的凋亡调控。通过生物学手段特异性下调KLF6的表达有可能在一定程度上发挥对HLECs的保护作用。

Krüppel样因子6对于TGF-β1诱导的晶状体上皮细胞纤维化的调控作用研究

目的探讨Krüppel样因子6(KLF6)高表达对于转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人晶状体上皮细胞(HLECs)纤维化的促进作用。方法利用脂质体转染的方法将已成功构建的真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6及pSilencer-KLF6转染到HLECs中,经实时定量PCR反应(q-PCR)与反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞中KLF6蛋白的表达水平,以及上皮钙黏素(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表达水平。经Transwell细胞迁移实验观察细胞迁移情况。结果 pEGFP-C2-KLF6转染72 h后可有效上调HLECs中KLF6的表达水平,pSilencer-KLF6转染72 h后可有效下调HLECs中KLF6的表达水平(P<0.05),从而为后续实验奠定基础;与对照组相比较,KLF6高表达组细胞中E-cadherin表达水平显著下降,Vimentin表达水平显著增高,细胞迁移能力升高(P<0.05);在0.5 ng/ml TGF-β1刺激72h后,随KLF6表达量的增加,E-cadherin表达水平进一步降低,而Vimentin表达水平进一步增高,细胞迁移能力进一步升高(P<0.05)。结论高表达的KLF6通过调控E-cadherin和Vimentin的表达水平,促进了TGF-β1所诱导的人晶状体上皮细胞纤维化过程,KLF6基因表达与体外基础条件下的上皮-间充质转化(EMT)相关。通过生物学手段特异性下调KLF6的表达可在一定程度上发挥对晶状体上皮细胞的保护作用。

ROCK2和KLF6在急性缺血性脑卒中的表达变化及其与病情程度和预后的相关性

目的探究Rho相关蛋白激酶2(ROCK2)和Krüppel样因子6(KLF6)在急性缺血性脑卒中(AIS)患者血清表达变化及其与病情程度和预后的相关性。方法选取2021年1月至2023年3月在我院确诊的117例AIS患者作为研究组,另选120例在我院同期体检健康者作为对照组。根据美国国立卫生院神经功能缺损(NIHSS)评分,将患者分为轻度(46例)、中度(40例)、重度(31例)组。根据改良Rankin量表将患者分为预后良好(74例)和预后不良(43例)组。酶联免疫吸附试验测定血清ROCK2和KLF6水平。Spearman分析ROCK2和KLF6水平与NIHSS评分的关系;多因素Logistic回归分析AIS患者预后不良的危险因素;受试者工作特征(ROC)曲线分析血清ROCK2和KLF6水平对AIS患者预后不良的预测价值。结果与对照组相比,研究组ROCK2和KLF6水平显著增加(P<0.05)。与轻度组相比,中度组和重度组ROCK2和KLF6水平及NIHSS评分显著增加(P<0.05),与中度组相比,重度组ROCK2和KLF6水平及NIHSS评分显著增加(P<0.05)。相关性分析结果显示,ROCK2和KLF6水平与NIHSS评分均呈正相关(r=0.605,0.632,P<0.001)。与预后良好组相比,预后不良组患者ROCK2和KLF6水平显著增加(P<0.05)。ROCK2、KLF6单独及联合预测AIS患者预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.886(95%CI 0.822~0.949)、0.850(95%CI 0.770~0.930)、0.954(95%CI 0.919~0.988)。预后良好组与预后不良组患者总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平及NIHSS评分比较差异具有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示TG水平、NIHSS评分、ROCK2和KLF6是AIS患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。结论AIS患者ROCK2和KLF6表达上调,其水平与病情程度及预后不良密切相关。

壮族家系Krüppel样因子6基因多态性与肝癌易感性的关系

目的探讨Krüppel样因子6(KLF6)基因rs7634位点多态性与壮族人群肝细胞癌(HCC)易感性的关系。方法选取广西扶绥县壮族人群10个正常对照家系(40例)及20个肝癌家系(79例),后者包括HCC患者20例及其未患HCC的直系亲属59例。运用质谱方法检测KLF6基因rs7634位点基因型及等位基因的分布频率;应用非条件logistic回归分析不同基因型及等位基因与HCC发病的关系。结果在肝癌患者、肝癌家系亲属和正常家系人群中,KLF6基因rs7634位点TT基因型的分布频率分别为40.00%、54.24%和87.50%,TA基因型的分布频率分别为60.00%、42.37%和12.50%,AA基因型的分布频率分别为0、3.39%和0,T等位基因的分布频率分别为70.00%、75.42%和93.75%,A等位基因的分布频率分别为30.00%、24.58%和6.25%。在肝癌患者及正常家系人群中,携带TA基因型个体发生肝癌的风险是TT基因型个体的10.5倍(P<0.05),携带A等位基因个体发生肝癌的风险是T基因型个体的6.429倍(P<0.05);在肝癌患者及肝癌家系直系亲属中,携带TA基因型个体发生HCC的风险是TT基因型个体的1.667倍,携带A基因型个体发生肝癌的风险是T基因型个体的1.257倍,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 KLF6基因rs7634多态性与壮族家系肝癌易感性关系密切,携带TA基因型或A等位基因可能是HCC发生的危险因素。

血清IL-6、KLF2、SP-D与新生儿急性呼吸窘迫综合征严重程度及预后的相关性

目的 探究血清白细胞介素-6(IL-6)、Krüppel样转录因子2(KLF2)、血清肺表面活性蛋白D(SP-D)与新生儿急性呼吸窘迫综合征(ARDS)严重程度及预后的相关性。方法 分析2022年1月至2023年6月期间北京市通州区妇幼保健院收治的ARDS资料224例;根据氧指数将ARDS组患儿分为轻度组(n=87)、中度组(n=74)和重度组(n=63);根据患儿结局分为预后良好组(n=145)和预后不良组(n=79)。比较不同病情严重程度患儿血清IL-6、KLF2、SP-D水平差异;分析血清IL-6、KLF2、SP-D水平与氧指数的相关性及对ARDS患儿预后情况的预测价值。结果 随ARDS患儿病情加重血清IL-6、SP-D水平逐渐升高,KLF2水平逐渐下降,差异均具有统计学意义(F=155.041、56.005、198.070,P<0.05);相比预后良好组,预后不良组患儿血清IL-6、SP-D水平更高,KLF2水平更低,差异具有统计学意义(t=8.681、8.038、7.823,P<0.05);ARDS患儿病情严重程度与血清IL-6、SP-D水平正相关(r=0.823、0.786,P<0.05),与KLF2水平负相关(r=-0.761,P<0.05),ROC曲线结果显示三者单独及联合检测预测ARDS患儿预后的曲线下面积分别为:0.806、0.794、0.767、0.914,优于单一检测(P<0.05)。结论 血清IL-6、KLF2、SP-D水平与新生儿急性呼吸窘迫综合征病情严重程度密切相关,对于ARDS患儿预后具有一定预测价值,三者联合检测具有更高预测效能。

Kuippel样因子6经活化转录因子4通路对晶状体上皮细胞凋亡的调控作用

目的以活化转录因子4（ATF4）为靶点，探讨Krüppel样因子6（KLF6）调控紫外线B（UVB）诱导的晶状体上皮细胞（HLECs）凋亡的分子机制。方法HLECs系（HLE-B3）进行常规培养，采用脂质体转染法将构建的真核表达质粒pEGFP-C2-ATF4转染HLECs作为UVB＋ATF4转染组，并用能量密度为20 mJ/cm2的UVB照射细胞；未转染的ATF4细胞作为正常对照组。采用苏木精－伊红染色法和Hoechst染色法观察ATF4对HLECs细胞形态学的影响。将培养的细胞分为KLF6转染组及相应空质粒对照组，小干扰KLF6（siKLF6）组（转染pSilencer-KLF6质粒）及相应的空载体对照组（转染pSilencer空质粒），采用Western blot法检测细胞中ATF4蛋白的相对表达量。将培养的细胞分为4个组，联合空载体组HLECs联合转染pEGFP-C2空载体和pSilencer空载体；KLF6＋pSilencer空质粒组HLECs联合转染pEGFP-C2-KLF6和pSilencer空载体；小干扰ATF4（siATF4）＋pEGFP-C2组HLECs联合转染pEGFP-C2空载体和pSilencer-ATF4；KLF6＋siATF4组HLECs联合转染pEGFP-C2-KLF6和pSilencer-ATF4，各组细胞均暴露于UVB 200 s，采用ELISA法检测上述各组HLECs凋亡值。结果正常对照组培养的HLECs大小均匀，排列整齐，细胞核呈卵圆形，数量多且完整；UVB照射后部分细胞核固缩，细胞间隙增大，少数细胞出现核分裂；UCB＋ATF4转染组细胞数量减少，多数细胞出现核固缩和核分裂。UVB＋ATF4转染组细胞中ATF4蛋白表达条带灰度明显强于UVB＋空载体组，ATF4蛋白相对表达量分别为0.99±0.06和0.13±0.02，差异有统计学意义（t＝23.13，P〈0.01）。KLF6转染组细胞中KLF6和ATF4蛋白相对表达量均明显高于其空载体对照组，siKLF6组细胞中KLF6和ATF4蛋白相对表达量均明显低于其空载体对照组，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。ELISA检测显示ATF4转染组HLECs凋亡值为1.37±0.11，明显高于正常对照组的0.31±0.11，差异有统计学意义（t＝8.034，P＝0.001）；KLF6＋pSilencer空质粒组细胞凋亡值明显高于联合空载体组，siATF4＋pEGFP-C2组细胞凋亡值明显低于联合空载体组，差异均有统计学意义（P〈0.01，P＝0.02）；KLF6＋siATF4组细胞凋亡率明显低于KLF6＋pSilencer空质粒组，差异有统计学意义（P〈0.01）。 结论KLF6通过活化ATF4促进UVB诱导的HLECs凋亡，ATF4基因沉默可使细胞凋亡值明显降低，因此ATF4可作为KLF6调控HLECs凋亡的靶因子，也是KLF6调控LECs凋亡的主要生物机制之一。

HEK 293T细胞中TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式及其修饰位点的鉴定

目的:研究人胚肾293T(HEK 293T,简称293T)细胞中外源性肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6,TRAF6)与Krüppel样因子5(Krüppel⁃like factor 5,KLF5)的结合及TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式和修饰的位点。方法:将构建的Flag⁃TRAF6、HA⁃KLF5、泛素过表达质粒、shTRAF6小干扰质粒和TRAF6 C70A位点突变质粒行不同组合转染293T细胞48 h。用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和免疫印迹(immunoblotting,IB)实验检查TRAF6与KLF5的结合以及KLF5 K63或K48多聚泛素化水平。此外,构建KLF5全部赖氨酸突变的质粒,分别与TRAF6质粒共转染293T细胞。用前述IP/IB检测KLF5 K63连接的多聚泛素化修饰,并确定KLF5 K63泛素化修饰的位点。结果:293T细胞中TRAF6能与KLF5结合;TRAF6过表达和基因沉默或TRA6酶活性缺失能相应上调或下调KLF5 K63的多聚泛素化;KLF5被TRAF6 K63多聚泛素化修饰的位点是其第99位和第100位的赖氨酸。结论:TRAF6能与KLF5相互作用,并对KLF5⁃K99和K100进行K63多聚泛素化修饰。

CSE/H2S通过KLF6拮抗ox-LDL诱导的内皮细胞炎症反应

目的 氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导内皮细胞炎症反应,促进单核巨噬细胞黏附是动脉粥样硬化发生的重要病理生理机制。硫化氢（H2S）是新型气体信号分子,可拮抗动脉粥样硬化并抑制内皮细胞炎症反应。本研究以Krüppel样因子（KLF）家族为切入点,探究KLF6在H2S拮抗ox-LDL诱导内皮细胞炎症反应中的调节机制。方法 以人主动脉内皮细胞（HAEC）为研究对象,观察ox-LDL对HAEC内源性胱硫醚γ裂解酶（CSE）/H2S系统及内皮细胞炎症反应的影响。实时定量PCR检测外源性给予H2S供体或过表达CSE对KLF家族及炎症因子表达的改变,进一步采用siRNA干扰KLF6观察其对内皮细胞炎症反应、单核细胞黏附的影响。同时采用染色质免疫共沉淀（Ch IP）技术观察H2S供体对KLF6转录活性的影响。结果 Western blot检测及H2S荧光探针细胞内染色发现,ox-LDL可以呈时间及剂量依赖性下调CSE表达以及内皮细胞H2S的产生。实时定量PCR检测发现,ox-LDL抑制KLF6表达而上调KLF10表达,H2S处理后则上调KLF6表达,抑制KLF10表达。Western blot证实Na HS或过表达CSE均可显著上调KLF6蛋白表达。Na HS处理显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞炎症因子ICAM-1、VCAM-1的表达水平和单核细胞对内皮细胞的黏附,敲低KLF6则阻断Na HS的抑炎效应。Ch IP结果也显示,oxLDL促进KLF6与CXCL2、IL-8以及自噬基因ATG7启动子区的结合,Na HS处理或过表达CSE均可显著抑制KLF6的DNA结合活性。结论 ox-LDL下调内皮细胞CSE/H2S系统,H2S供体或增加内源性CSE可通过KLF6这一转录因子拮抗ox-LDL诱导的内皮细胞炎症反应。

KLF6在胃癌和癌前病变中的表达及其意义

目的:探讨KLF6(krüppel-like factor 6)在胃癌和癌前病变中的表达及其意义.方法:收集郑州大学第二附属医院手术切除32例胃癌组织及其配对的正常胃黏膜组织新鲜标本,采用RT-PCR检测组织中KLF6 mRNA的表达.同期收集20例正常胃黏膜、45例肠上皮化生、16例异型增生及30例胃癌组织存档蜡块,采用免疫组织化学SP法检测组织中KLF6蛋白的表达,并结合临床资料进行分析.结果:正常胃黏膜与Ⅲ型肠上皮化生、异型增生及胃癌组间KLF6蛋白的表达差异有统计学意义(均P<0.05);KLF6蛋白的表达与肿瘤分化程度、肿瘤大小相关,差异有统计学意义(均P<0.05).正常胃黏膜与胃癌组织KLF6 mRNA表达差异无统计学意义(P=0.357).结论:KLF6蛋白的表达异常与Ⅲ型肠化、异型增生、胃癌的发生发展密切相关,其在监测癌前病变的进展及早期胃癌的发现中有一定价值.

KLF6与肿瘤研究进展

Krüppel样转录因子6(Krüppel-like factor 6,KLF6)是哺乳动物细胞中普遍表达的核内转录因子,其与肿瘤的发生、发展密切相关,从KLF6的结构及其在肿瘤发生中的作用机制2个方面进行综述。

控制血糖通过下调KLF6而抑制STZ所致的1型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞损伤

目的:用胰岛素(INS)控制1型糖尿病(DM)大鼠血糖,观察糖尿病肾病(DKD)发病过程中大鼠肾小管上皮细胞核转录因子Krüppel样因子6(KLF6)的表达和作用。方法:(1)将SD大鼠随机分为正常对照(NC)组、DM组和INS治疗组(INS组)。采用链脲佐菌素(STZ)复制1型DM大鼠模型,INS组于造模成功4周后给予INS(22 U·kg^(−1)·d^(−1))治疗6周。于造模后第10周处死所有大鼠,检测相应生化指标;HE和天狼星红染色观察肾组织病理学变化;免疫组织化学染色法检测肾组织KLF6的表达;Western blot检测大鼠肾组织中KLF6、过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)和Bax蛋白的表达水平;RT-qPCR检测PPARγ的mRNA表达变化。(2)将大鼠近端肾小管上皮NRK-52E细胞予以正常糖(NG)或高糖(HG)培养以及在HG环境中培养24 h后置于NG中培养24 h(HGtoNG),或转染KLF6 siRNA(si-KLF6)后HG培养及转染KLF6过表达质粒(OE-KLF6)后NG培养,分为NG组、HG组、HGtoNG组、NG+vector组、NG+OE-KLF6组和HG+si-KLF6组,共6组。Western blot检测KLF6、PPARγ、钙黏蛋白(E-cadherin)、纤维连接蛋白(FN)、IL-6和Bax表达的变化,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:(1)与NC组相比,DM组大鼠肾重/体重、血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、血尿素氮和24 h尿蛋白明显升高,肾小管灶性萎缩,系膜及间质轻度节段增生,并伴有胶原的明显沉积,肾组织KLF6、IL-6、TNF-α、α-SMA、ColⅢ和Bax蛋白表达增多,KLF6阳性染色主要定位在肾小管胞质及胞核,而PPARγ的mRNA和蛋白表达水平均降低。与DM组相比,INS治疗后,上述生化指标均降低,肾组织病理形态学显示肾纤维化病变减轻,KLF6、IL-6、TNF-α、α-SMA、ColⅢ和Bax蛋白表达均有所降低,而PPARγ的mRNA和蛋白表达水平均升高。(2)过表达KLF6可使NRK-52E细胞中PPARγ和E-cadherin的表达降低,FN和IL-6表达增加,细胞凋亡率增加;敲减KLF6表达可使得上述效应反转。与NG组相比,HG组KLF6、FN和IL-6表达增加,PPARγ和E-cadherin表达减少;与HG组相比,HGtoNG组上述效应反转。结论:HG可使KLF6蛋白表达增多,抑制PPARγ的mRNA和蛋白表达;KLF6可能通过抑制PPARγ而影响炎症因子的表达和凋亡反应,加剧了纤维化进程,从而参与DKD的发生发展;而控制血糖可通过下调KLF6而抑制1型DM大鼠肾小管上皮细胞损伤。

Krüppel样转录因子6和Ki-67蛋白在皮肤黑色素瘤中表达及意义

目的探讨Krüppel样转录因子6(Krüppel-like factor 6,KLF6)和Ki-67蛋白在皮肤黑色素瘤中的表达及二者相关性。方法 30例皮肤黑色素瘤患者为黑色素瘤组,30例皮内痣患者为皮内痣组,采用免疫组织化学法检测2组组织中KLF6和Ki-67蛋白表达情况。结果皮肤黑色素瘤组KLF6和Ki-67蛋白阳性表达率分别为21.43%和100.00%,阳性细胞率分别为(17.22±24.86)%和(42.65±15.31)%,皮内痣组KLF6和Ki-67蛋白阳性表达率分别为100.00%和13.33%,阳性细胞率分别为(53.47±16.25)%、(7.65±3.38)%,2组上述指标比较差异均有统计学意义(P<0.05);黑色素瘤组KLF6与Ki-67蛋白的表达呈负相关(r=-0.862,P=0.006)。结论 KLF6低表达、Ki-67蛋白高表达可能与皮肤黑色素瘤的形成、发展相关,二者联合检测对皮肤黑色素瘤的诊断及预后评估有重要意义。

KLF4反义基因对内皮细胞血管性血友病因子、纤溶酶原抑制物-1表达的影响

目的 探讨类果蝇分节因子4（Kroppel-like factor4,KLF4）反义基因对原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中血管性血友病因子（vWF）、纤溶酶原抑制物-1（PAI-1）表达的影响,明确KLF4在内皮细胞调节血栓形成中的作用.方法 胰蛋白酶消化法分离和培养原代HUVEC,采用同源重组方法 构建携带反义KLF4基因腺病毒,实时定量（Real-time）PCR、Western blot、激光共聚焦显微镜法检测转染KLF4反义基因后内皮细胞KLF4、PAI-1、vWF mRNA和蛋白的表达.结果 成功构建出携带反义KLF4基因片段的重组腺病毒（Ad-反义KLF4）,以感染复数值200的重组腺病毒感染HUVEC,KLF4 mRNA相对表达水平由0.59±0.01下降至0.44±0.06,同时HUVEC中vWF mRNA相对表达水平升至1.17±0.05,与感染携带绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-GFP）组（1.04±0.03）相比,差异均具有统计学意义（P〈0.05）.而HUVEC中PAI-1 mRNA相对表达水平增加至0.73±0.01,与感染Ad-GFP组（0.67±0.04）相比,差异无统计学意义（P〉0.05）.与感染Ad-GFP组相比,感染Ad-反义KLF4的HUVEC中vWF、PAI-1蛋白表达水平明显增加.结论 KLF4反义基因可下调KLF4表达,促进内皮细胞中vWF、PAI-1的表达.KLF4可能参与内皮细胞抗栓作用的转录调节.