Krüppel样因子4通过支持PPARγ信号通路维持细胞稳态以保护血管平滑肌细胞免受泡沫细胞样表型转化的损害

动脉粥样硬化(AS)被普遍认为是一种血管壁细胞(包括内皮细胞和血管平滑肌细胞)、循环细胞以及固有免疫原性细胞(例如单核细胞/巨噬细胞)等多种细胞综合作用引起的炎症性疾病。其中血管平滑肌细胞(VSMCs)胆固醇超负荷形成的泡沫细胞可能在动脉粥样硬化的进展中发挥重要作用。Krüppel样因子4(KLF4)是一种关键的抗炎转录因子,尤其在心血管疾病方面,已被证实发挥了重要的血管功能保护作用。然而,目前尚不清楚KLF4是否在AS过程胆固醇对VSMCs的损伤中发挥保护作用。该研究旨在探讨KLF4在AS进展过程中VSMCs泡沫细胞样表型转化的作用及其分子机制。小鼠AS造模结果显示,KLF4缺失增加动脉粥样硬化斑块面积(P<0.05),并增加动脉壁脂质蓄积(P<0.05)及血清胆固醇含量(P<0.05),加速AS进展。细胞内油红O染色及胆固醇含量测定研究证实,KLF4缺失促进VSMCs内胆固醇蓄积(P<0.05)。QRT-PCR和Western印迹结果证实,KLF4缺失促进VSMCs胆固醇摄取、合成、促炎因子分泌及巨噬细胞黏附和胆固醇损伤诱导的巨噬细胞标志物的表达(P<0.05),抑制胆固醇流出和氧化相关基因及收缩表型标志物的表达(P<0.05),加速VSMCs源性泡沫细胞形成。KLF4敲除VSMCs中利用腺病毒Ad-GFP-KLF4补救表达KLF4,显著逆转上述改变,并阻断由胆固醇蓄积诱导的TLR4-MyD88-p65通路的激活。随后,siRNA诱导的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的选择性基因消融消除了KLF4的这些作用。总之,我们的研究结果提示,KLF4通过激活PPARγ途径,抑制胆固醇摄取和合成,加速胆固醇流出,同时抑制促炎因子分泌、巨噬细胞黏附和胆固醇损伤诱导的巨噬细胞标志物表达,从而在VSMCs中实现对胆固醇刺激的保护作用。

转录因子KLF2和KLF4调控人血管内皮细胞血管稳态相关基因表达的特征

[目的]Krüppel样因子(KLF)2和4是与血管稳态密切相关的两个核心转录因子,具有抗炎、抗钙化、抗血栓等多重保护效应。本研究旨在在内皮细胞中阐明并验证KLF2和KLF4共同调控的血管稳态相关基因谱。[方法]使用腺病毒(Ad-KLF2或Ad-KLF4)及对照病毒(Ad-NC)处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC)24 h后提取RNA并进行转录组测序分析。过表达KLF2和KLF4的测序结果与已报道的KLF2/KLF4双基因敲除鼠测序结果进行叠加。筛选出的差异表达基因通过实时荧光定量PCR在Ad-KLF2或Ad-KLF4处理的HUVEC以及在阿托伐他汀或白藜芦醇处理的HUVEC中进行验证。[结果]转录组学叠加发现,KLF2和KLF4上调的差异基因有256个,KEGG通路富集分析显示这些差异基因主要富集于肥厚型心肌病、扩张型心肌病、ECM-受体交互以及黏着斑、致心律失常性右心室心肌病等;KLF2和KLF4下调的差异基因有145个,KEGG通路富集分析显示这些差异基因主要富集于癌症中的microRNA、糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮聚糖、矿物质吸收、p53信号通路以及氨基酸生物合成等。最终通过验证得到6个受到KLF2和KLF4调控的新基因。[结论]FGFR3、SEMA4B、SEMA6A、PTX3、FABP4和FABP5可能是内皮细胞中转录因子KLF2和KLF4调控血管稳态的新基因。

Krüppel样因子4在肿瘤相关巨噬细胞极化中的作用机制研究进展

Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)是一种参与细胞生长与分化的核转录因子,在人体中具有促进和抑制基因活化的双向作用。近年来,有大量的研究表明KLF4在M2型巨噬细胞中的表达远高于M1型巨噬细胞,是肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)极化的关键调节因子,且研究表明KLF4可通过白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)相关信号通路等多种途径参与TAM细胞表型分化。鉴于TAM在肿瘤的发生发展、转移和耐药性中发挥重要的调控作用,进一步深入研究KLF4对TAMs活化的分子调控机制,有望成为癌症治疗的潜在干预靶点。

CXCR4 MFAP2 KLF4在分化型甲状腺癌中的表达及对预后的预测价值研究

目的:研究趋化因子4受体(CXCR4)、微纤维相关蛋白2(MFAP2)、Krüppel样因子4(KLF4)在分化型甲状腺癌(DTC)中的表达及对预后的预测价值。方法:选择我院2019年7月至2020年7月收治的113例DTC患者,术中留取其肿瘤组织及癌旁正常组织。采用蛋白免疫印迹法检测DTC组织及癌旁正常组织中CXCR4、MFAP2、KLF4表达水平,分析CXCR4、MFAP2、KLF4表达水平与DTC临床病理特征的关系。对DTC患者进行3年随访,统计3年总生存情况,比较死亡组与存活组CXCR4、MFAP2、KLF4表达水平,采用ROC曲线分析CXCR4、MFAP2、KLF4对DTC预后的预测价值,采用Cox回归模型进行DTC预后单因素和多因素分析。结果:与癌旁正常组织比较,DTC组织CXCR4、MFAP2蛋白表达量显著升高(P<0.05),KLF4蛋白表达量显著降低(P<0.05)。TNM分期Ⅲ期、发生淋巴结转移、肿瘤低分化者CXCR4、MFAP2蛋白表达量显著高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、未发生淋巴结转移、肿瘤中高分化者(P<0.05),TNM分期Ⅲ期、发生淋巴结转移、肿瘤低分化者KLF4蛋白表达量显著低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、未发生淋巴结转移、肿瘤中高分化者(P<0.05)。113例DTC患者随访3年期间失访8例,最终获得随访者105例。死亡组患者CXCR4、MFAP2蛋白表达量显著高于存活组(P<0.05),KLF4蛋白表达量显著低于存活组(P<0.05)。绘制ROC曲线发现,CXCR4、MFAP2、KLF4单独或联合预测DTC预后的AUC(95%CI)分别为0.692(0.562~0.823)、0.729(0.590~0.869)、0.766(0.622~0.910)、0.832(0.690~0.975),联合预测的效能显著优于单项检测(P<0.05)。Cox回归分析显示,淋巴结转移、TNM分期Ⅲ期、肿瘤低分化、CXCR4表达升高、MFAP2表达升高、KLF4表达降低是DTC预后的危险因素(P<0.05)。结论:分化型甲状腺癌患者肿瘤组织中CXCR4、MFAP2呈高表达,KLF4呈低表达,其表达水平与淋巴结转移、肿瘤分化程度、TNM分期及3年总生存率相关,三者联合检测有助于预测分化型甲状腺癌预后。

血清KLF5和actinin-4水平与肝细胞肝癌肝动脉化疗栓塞术治疗预后的关系

目的探讨血清Krüpple样因子5(KLF5)、辅肌动蛋白4(actinin-4)对肝细胞肝癌(HCC)肝动脉化疗栓塞术(TACE)治疗预后的关系。方法选取西安交通大学第二附属医院2015年3月至2020年3月期间收治的130例HCC患者作为HCC组,同期收治的86例肝硬化患者作为对照。术后随访3年,根据生存结局分为生存组(n=38)和死亡组(n=92)。采用ELISA检测各组血清KLF5和actinin-4水平,并分析血清KLF5与actinin-4水平之间的相关性;Cox回归分析HCC患者预后死亡的影响因素;受试者工作特征曲线(ROC)评估血清KLF5和actinin-4水平对HCC患者预后死亡的预测价值。结果死亡组患者血清KLF5和actinin-4水平明显高于生存组(P<0.05),且血清KLF5与actinin-4水平呈正相关(P<0.001);低分化、中国肝癌分期方案(CNLC)分期为Ⅲa期、血管侵犯、KLF5和actinin-4水平升高是HCC患者预后死亡的危险因素(P<0.05);血清KLF5和actinin-4单独及联合预测HCC患者预后死亡的曲线下面积(AUC)分别为0.835、0.866、0.936,联合预测效果较高(Z二者联合-KLF5=2.792,P=0.005,Z二者联合-actinin-4=2.014,P=0.044)。结论HCC患者血清KLF5和actinin-4水平升高,二者血清水平对预后具有较高预测价值。

食管癌组织中Krüppell样因子4的表达及其临床意义

目的探讨Krüppell样因子4(KLF4)表达与食管癌临床病理特征及预后的关系。方法收集2011年1月至2011年6月经病理确诊的食管癌组织及癌旁组织标本60例,采用免疫组化和实时荧光定量PCR(QPCR)分别检测上述组织中KLF4的表达情况,分析KLF4表达与食管癌临床病理特征(性别、年龄、吸烟史、饮酒史、分化程度、淋巴结转移和临床分期)及预后的关系。结果 KLF4蛋白表达于细胞质和胞核。食管癌组织中KLF4蛋白阳性表达率和mRNA水平分别为41.7%(25/60)和0.445±0.268,低于癌旁组织的80.0%(48/60)和1.162±0.676,差异有统计学意义(P<0.05)。KLF4表达与性别、年龄、吸烟、饮酒和分化程度均无关(P>0.05),与淋巴结转移和临床分期有关(P<0.05)。淋巴结转移者的KLF4蛋白阳性表达率和mRNA水平分别为21.7%(5/23)和0.289±0.091,低于无淋巴结转移者的54.1%(20/37)和0.466±0.019;TNMⅢ期的KLF4蛋白阳性表达率和mRNA水平分别为21.7%(5/23)和0.263±0.058,均低于Ⅰ期的57.1%(4/7)和0.458±0.033及Ⅱ期的53.3%(16/30)和0.423±0.064,以上差异均有统计学意义(P<0.05)。食管癌患者中KLF4蛋白阳性表达组的中位总生存期(OS)为52.4个月,高于阴性表达组的23.2个月;而KLF4 mRNA高表达组的中位OS为50.1个月,高于低表达组的25.5个月,以上差异有统计学意义(P<0.05)。Cox多因素分析显示,分化程度、TNM分期和KLF4表达是影响食管癌患者OS的独立因素(P<0.05)。结论 KLF4在食管癌中表达下调并与食管癌发生、发展和预后有关,可作为食管癌预后的判断指标及潜在的治疗靶点。

食管癌患者卡瑞利珠单抗治疗前后血清KLF4、ANXA1水平变化及对疾病转归的交互作用分析

目的探讨食管癌患者卡瑞利珠单抗治疗前后血清Krüppel样因子4(KLF4)、膜联蛋白A1(ANXA1)水平变化及对疾病转归的交互作用。方法选取2020年5月至2023年5月在我院就诊的食管癌患者109例为观察组,均采用卡瑞利珠单抗治疗。选取同期健康体检者109例为对照组。治疗前、治疗4周、治疗6周时,检测患者血清KLF4、ANXA1水平。观察组治疗6周时,采用实体瘤免疫治疗疗效评价标准评估疾病转归,根据评估结果分为转归差和转归良好。绘制受试者工作特征曲线(ROC)评估治疗前KLF4、ANXA1预测食管癌患者疾病转归的价值。分析观察组疾病转归的影响因素及KLF4、ANXA1对疾病转归的交互作用。结果观察组治疗前、治疗4周及6周时,血清KLF4[(31.05±5.92)ng/L、(38.62±6.07)ng/L、(42.58±6.29)ng/L]、ANXA1[(0.94±0.26)μg/L、(1.09±0.27)μg/L、(1.25±0.30)μg/L]水平低于对照组[(53.06±6.85)ng/L、(1.50±0.32)μg/L],差异有统计学意义(P<0.05);治疗4周及6周时,观察组患者血清KLF4、ANXA1水平升高(P<0.05),且治疗6周时高于治疗4周时(P<0.05)。治疗前KLF4、ANXA1联合评估食管癌患者疾病转归的AUC值与单独评估相比,差异有统计学意义(P<0.05);调整混杂因素后,KLF4、ANXA1均为食管癌患者疾病转归的独立影响因素(P<0.05);KLF4与ANXA1对食管癌患者疾病转归存在协同作用,协同效应为二者单独存在产生效应之和的2.212倍。结论食管癌患者血清KLF4、ANXA1呈低表达,经卡瑞利珠单抗治疗后升高,二者的协同作用有助于疾病转归。

KLF4通过促进自噬减轻高糖浓度下巨噬细胞胆固醇沉积

目的观察Krüppel样因子4(KLF4)对高糖处理的巨噬细胞胆固醇沉积的影响,并探讨其作用机制是否与巨噬细胞自噬相关。方法10只Balb/c小鼠随机分为正常对照(NC)组和糖尿病(DM)组,每组5只。建立DM小鼠模型,给予高脂饮食后检测小鼠主动脉KLF4蛋白表达水平。人白血病单核细胞THP-1诱导为巨噬细胞后分为LVNC组、LV-KLF4组、si-NC组、si-KLF4组。观察过表达或敲低KLF4表达后,THP-1巨噬细胞胆固醇含量、细胞凋亡、自噬相关蛋白及蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(AKT/mTOR)信号通路相关蛋白的表达变化。结果DM组小鼠主动脉KLF4蛋白表达水平低于NC组(P<0.05)。KLF4过表达可显著降低高糖条件下的THP-1巨噬细胞胆固醇积累,增加苄氯素1(Beclin1)表达,降低P62表达,提高微管相关蛋白1轻链3(LC3)荧光强度,减少细胞凋亡(P<0.05),抑制AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达(P<0.05)。敲低KLF4表达后,结果反之。结论KLF4通过促进自噬减轻高糖浓度下巨噬细胞胆固醇沉积。

miR-7靶向调控KLF4对结肠癌干细胞生物学行为的影响

目的探讨微小核糖核酸7(miR-7)靶向调控Krüppe样因子4(KLF4)对结肠癌干细胞生物学行为的影响。方法体外传代培养结肠癌干细胞。取传15代、对数生长期、生长状态良好的结肠癌干细胞,随机分为对照组、NC mimics组、miR-7 mimics组,NC mimics组和miR-7 mimics组分别转染空载质粒、miR-7 mimics质粒,对照组不予转染。采用RT-qPCR法验证转染效率。收集各组转染48 h结肠癌干细胞,采用CCK-8法检测细胞活力,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力,采用改良Boyden小室法检测细胞侵袭能力,采用流式细胞术检测细胞凋亡率。通过TargetScan在线网站预测miR-7与KLF4的结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-7对KLF4的靶向调控作用。收集各组转染48 h结肠癌干细胞,分别采用RT-qPCR法、Western blotting法检测KLF4 mRNA和蛋白表达。结果miR-7 mimics组miR-7相对表达量高于对照组和NC mimics组(P均<0.05),而对照组与NC mimics组比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-7 mimics组细胞存活率、细胞迁移率、穿膜细胞数均低于NC mimics组和对照组,细胞凋亡率高于NC mimics组和对照组(P均<0.05);NC mimics组与对照组细胞存活率、细胞迁移率、穿膜细胞数、细胞凋亡率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。经TargetScan在线网站预测,KLF4基因的3′非翻译区存在miR-7的结合位点;经双荧光素酶报告基因实验验证,miR-7对KLF4存在靶向调控作用。miR-7 mimics组KLF4mRNA与蛋白相对表达量均低于NC mimics组和对照组(P均<0.05),而NC mimics组与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论miR-7可通过靶向下调KLF4表达而抑制结肠癌干细胞的增殖、侵袭、迁移并促进其凋亡。

高糖炎性环境下KLF4调控人牙周膜干细胞能量代谢的机制初探

目的:探究高糖炎性环境下Krüppel样因子4(KLF4)对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)线粒体能量代谢和成骨分化的影响。方法:利用免疫荧光和Western blot实验研究高糖炎性环境下KLF4在hPDLSCs的定位和表达情况。通过碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色等检测高糖炎性环境下hPDLSCs成骨能力。通过慢病毒敲低和过表达技术,结合实时荧光定量PCR与Western blot实验检测病毒感染后KLF4的表达,检测KLF4对hPDLSCs成骨分化的影响。采用核酸酶靶向切割和释放(CUT&RUN)技术,分析高糖炎性环境下hPDLSCs中KLF4结合的DNA及相关信号通路变化。使用Seahorse能量代谢仪探索KLF4对hPDLSCs氧化呼吸能力的影响。结果:高糖炎性环境下,hPDLSCs中KLF4表达下调、ALP活性降低、钙结节形成减少(均P<0.001),Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)表达降低(均P<0.001)。敲低KLF4,导致hPDLSCs的ALP活性降低(P<0.001),钙结节形成减少(P<0.001);过表达KLF4促进hPDLSCs的成骨分化。高糖炎性环境下,KLF4下游调控基因富集于能量代谢、成骨等相关通路。敲低KLF4导致hPDLSCs线粒体耗氧率(OCR)水平下调,而细胞外酸化率(ECAR)水平上调;过表达KLF4使OCR水平上调,而ECAR水平下调。结论:在高糖炎性环境下,hPDLSCs的成骨分化能力受损,KLF4可能通过上调线粒体氧化磷酸化能力来恢复hPDLSCs的成骨分化能力。

超声造影及TgAb、SP1和KLF4表达水平对分化型甲状腺癌临床分期的诊断价值

目的探讨超声造影及血清甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、特异性蛋白1(SP1)和Krüppel样因子4(KLF4)基因表达对分化型甲状腺癌(DTC)的诊断价值,并分析其相关性。方法采用便利抽样法选取手术治疗的130例DTC患者为研究对象,术前使用彩色多普勒超声诊断仪进行甲状腺检查,记录超声造影参数造影剂达峰时间(TIP)、平均通过时间(MTT)以及峰值强度(PI)。术前采集患者晨起空腹静脉血,检测血清TgAb、SP1和KLF4水平。收集患者术后病理标本,根据AJCC分级系统对DTC临床分期进行评估,比较不同分期患者的超声造影参数与血清TgAb、SP1、KLF4表达水平的差异;采用Spearman法进行DTC临床分期与TIP、MTT、PI、TgAb、SP1、KLF4水平相关性分析;绘制受试者工作特征曲线(ROC)分析超声造影与血清TgAb、SP1、KLF4水平对DTC临床分期的诊断效能。结果Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期,DTC患者TIP、MTT、PI和KLF4 mRNA相对表达水平依次降低,血清TgAb水平和SP1mRNA相对表达水平依次升高(P<0.001)。DTC临床分期与TIP、MTT、PI和血清KLF4 mRNA水平负相关(P<0.05),与血清TgAb、SP1 mRNA水平正相关(P<0.05)。超声造影、TgAb水平、SP1与KLF4 mRNA表达水平单一及联合诊断DTC的AUC依次为0.808、0.715、0.689、0.667、0.853,其中联合诊断AUC最大。结论DTC临床分期与超声造影参数TIP、MTT、PI和血清KLF4表达呈负相关关系,与血清TgAb、SP1表达呈正相关关系,将超声造影与血清TgAb、SP1和KLF4联合用于鉴别诊断DTC临床分期的效能最高。

敲低Krüppel样因子4(KLF4)促进RAW264.7巨噬细胞向M1型极化

目的研究敲低Krüppel样因子4(KLF4)基因对RAW264.7巨噬细胞极化的影响。方法采用RNA干涉技术(RNAi)构建敲低KLF4的慢病毒载体,转染RAW264.7巨噬细胞获得KLF4基因沉默的稳定细胞株。采用白细胞介素4(IL-4)刺激野生型、KLF4敲低组和阴性对照组巨噬细胞,反转录PCR检测细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及精氨酸酶1(Arg1)、IL-10、转化生长因子β(TGF-β)的mRNA水平,免疫细胞化学染色检测和定位巨噬细胞iNOS及Arg1蛋白。结果敲低KLF4基因后,RAW264.7细胞的iNOS、IL-1β的mRNA含量明显增高,而TNF-α、Arg1、IL-10及TGF-β的mRNA含量则明显降低;IL-4处理野生型RAW264.7细胞后KLF4、Arg1、IL-10及TGF-β的mRNA的表达增加,iNOS、IL-1β及TNF-αmRNA的表达减少;IL-4处理敲低KLF4的细胞,其iNOS、IL-1β及TNF-αmRNA含量低于野生型组,但高于阴性对照组,而Arg1、IL-10及TGF-βmRNA含量较高于野生型组,而Arg1及IL-10低于阴性对照组;IL-4处理敲低KLF4细胞12h后,与野生型细胞相比,iNOS蛋白表达显著减少,而Arg1的蛋白的表达则明显增加。结论敲低KLF4促进RAW264.7巨噬细胞向M1型极化、抑制巨噬细胞向M2型极化。

脊柱结核患者髓核中KLF4的表达及其与临床资料的相关性

目的探究Krüppel样因子4(Krüppel like factor 4,KLF4)在脊柱结核(spinal tuberculosis,STB)患者髓核组织中的表达及其与患者临床资料的相关性。方法选取2022年2月至2023年2月间我院确诊并行手术治疗的20例脊柱结核患者(STB组),术中收集结核病灶髓核组织;选取同期入院接受手术治疗的椎间盘突出症患者15例及外伤性脊柱骨折患者9例分别作为椎间盘突出组(ID组)和正常对照组(Ctrl组),术中收集髓核组织。免疫组织化学及RT-qPCR测定髓核组织中KLF4的表达水平,并分析其与症状持续时间、疼痛强度、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、血沉(Erythrocyte sedimentation rate,ESR)等临床资料的相关性。同时,免疫组织化学检测并分析脊柱结核患者髓核组织中γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)与KLF4之间的相关性。结果免疫组织化学检测显示脊柱结核组和椎间盘突出组髓核中KLF4免疫反应性较对照组明显增强;RT-qPCR测定显示脊柱结核组和椎间盘突出组KLF4 mRNA水平较对照组明显升高。同时,脊柱结核组患者KLF4基因表达水平与症状持续时间、疼痛强度、C-反应蛋白和血沉成显著正相关,而与患者的年龄、性别以及患病的脊柱节段无显著相关性。此外,脊柱结核组患者髓核组织中IFN-γ的表达显著升高,且其表达水平与KLF4呈明显的正相关。结论脊柱结核患者髓核组织中KLF4基因表达显著增高,且与预后相关,对脊柱结核的诊断及疗效评价具有重要的参考价值。

USP10对KLF4蛋白的调控及对肝细胞癌侵袭的影响

目的探究泛素特异蛋白酶10(USP10)对肝细胞癌(HCC)中Krüppe样因子4(KLF4)蛋白的调控及对HCC细胞增殖与侵袭的影响。方法采用Western blot实验检测USP10和KLF4在人正常肝细胞系L02和HCC细胞系HepG2、HUH7、HCCLM3等中的表达差异。选取HCCLM3和HUH7细胞,将过表达或沉默USP10的慢病毒颗粒(oe-USP10或sh-USP10)转染入细胞中,并将其记为oe-USP10组和oe-NC组。免疫共沉淀(Co-IP)实验检测HCCLM3或HUH7细胞中USP10是否可与KLF4直接结合。加入蛋白酶体抑制剂MG132,再次使用Co-IP检测转染oe-USP10或sh-USP10的HCCLM3和HUH7细胞中KLF4蛋白的泛素化水平。将过表达KLF4的pcDNA3.1载体质粒及其阴性对照质粒(pc-KLF4或pc-NC)共转染入HCCLM3和HUH7的sh-USP10组或sh-NC组细胞中,并将细胞记为sh-NC+pc-NC组、sh-USP10+pc-NC组、sh-NC+pc-KLF4组和sh-USP10+pc-KLF4组,采用CCK-8法检测HCCLM3和HUH7中各组细胞的增殖活力,Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力。结果与L02细胞比较,USP10和KLF4在HepG2、HUH7、HCCLM3等细胞中蛋白表达均降低(P<0.05)。在HCCLM3和HUH7细胞中,USP10蛋白可直接与KLF4相互结合。同时,MG132处理后,HCCLM3和HUH7细胞中KLF4蛋白表达量呈时间依赖性增加。沉默USP10可增加HCCLM3与HUH7细胞中KLF4的泛素化,过表达USP10可降低上述细胞中KLF4的泛素化水平。与sh-NC+pc-NC组比较,sh-USP10+pc-NC组中HCCLM3和HUH7的增殖和侵袭能力均升高(P<0.01),而sh-NC+pc-KLF4组和sh-USP10+pc-KLF4组的HCCLM3或HUH7细胞增殖和侵袭能力均降低(P<0.05);与sh-USP10+pc-NC组比较,sh-USP10+pc-KLF4组细胞的增殖和侵袭能力均降低(P<0.05)。结论在HCC细胞中USP10通过去泛素化促进KLF4蛋白稳定性,进而抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭。

血管平滑肌细胞KLF4对高血压小鼠模型心脏重塑的调控作用

目的 探讨血管平滑肌细胞Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)对高血压小鼠心脏重塑的调控作用。方法 采用皮下埋植缓释泵灌注血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)28 d建立小鼠高血压模型,剂量1 500 ng/(kg·min)。构建他莫昔芬诱导的血管平滑肌细胞Klf4基因特异敲除(Klf4-SMKO)小鼠,9~10周龄雄性Klf4-SMKO和Klf4-flox野生型小鼠各13只,分别随机分为2组,共4组:野生对照组(Klf4-flox+生理盐水灌注,6只),Klf4敲除对照组(Klf4-SMKO+生理盐水,6只),野生高血压模型组(Klf4-flox+Ang II,7只),Klf4敲除高血压模型组(Klf4-SMKO+Ang II,7只)。在建模0、7、14、21、28 d分别测量模型组小鼠血压;28 d心脏超声检测心功能;收取小鼠心脏检测心脏质量/体质量比值;切片进行麦胚凝集素和天狼猩红染色,分别检测心肌细胞大小和心脏纤维化重塑。结果 高血压建模后Klf4-SMKO和Klf4-flox两组小鼠的血压无明显差异,心脏超声检测平滑肌细胞Klf4特异性敲除降低了高血压模型小鼠左心室质量。Klf4敲除显著降低了高血压引起的心质量/体质量比值增加,并且抑制了高血压造成的心肌细胞肥大和心脏血管周围纤维化。结论 血管平滑肌细胞KLF4缺失改善了高血压小鼠心脏病理性重塑。

Krüppel样因子4在实验性肺纤维化小鼠肺组织中的表达及意义

目的探讨博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型中,Krüppel样因子4(KLF4)的表达及其意义。方法 C57BL/6小鼠随机分为生理盐水对照组(Control)和博莱霉素组(BLM),经气管内注入博莱霉素(2.5 mg/kg)建立实验性小鼠肺纤维化模型,注入等量生理盐水作为对照组,分别于术后第12 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d及28 d取材,采用HE染色和Masson染色观察肺组织病理变化及胶原的沉积部位和数量,实时定量PCR法和免疫组织化学法分别检测各组肺组织中KLF4 mRNA和蛋白表达水平。结果博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化过程中,第1、2及3 d表现为急性炎症;第7 d炎症加重,并出现胶原沉积;第14 d肺泡结构塌陷,胶原沉积明显;第28 d肺泡结构基本正常,炎症程度和胶原沉积较轻。与对照组相比,博莱霉素组小鼠肺组织中KLF4 mRNA的表达水平第1 d开始升高,而后降低,第3 d达最低后逐渐升高直至第28 d。博莱霉素组小鼠肺组织中KLF4蛋白的表达趋势与mRNA水平基本一致,第1 d开始升高,而后降低,第3 d达最低后逐渐增加至第14 d后再次降低。结论 KLF4在博莱霉素致肺纤维化过程中呈现明显的动态变化,并可能参与了肺纤维化的发生与发展。

Krüppel样因子4基因干扰对RAW264.7细胞凋亡和吞噬的影响

目的应用RNA干扰技术沉默小鼠RAW264.7巨噬细胞Krüppel样因子4(KLF4)基因,建立稳定干扰细胞株,观察其对细胞增殖、凋亡和吞噬活性的影响。方法针对小鼠KLF4基因设计合成重组KLF4 shRNA质粒,脂质体法将重组质粒转染至RAW264.7细胞,经G418筛选后获得稳定表达细胞株。Western blot法检测细胞中KLF4蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖活性;AnnexinV-FITC/PI双染色法检测细胞的凋亡情况;荧光素标记的大肠杆菌结合流式细胞仪检测细胞的吞噬活性。结果 KLF4 shRNA能明显抑制RAW264.7细胞的KLF4蛋白的表达,抑制率76%以上;从第3天开始,shKLF4组细胞的生长速度明显低于NC组(转染阴性质粒pGPU6/GFP/Neo-NC)(P<0.05);WT组(野生型RAW264.7)、NC组和shKLF4组的细胞凋亡率分别为:1.73%、6.85%和12.76%,shKLF4组明显高于NC组(P<0.05);各组细胞的平均荧光强度分别为:WT组(122.0±2.80)、NC组(48.97±5.69)和shKLF4组(80.10±4.61),与NC组相比,shKLF4组的细胞吞噬活性明显增高(P<0.05)。结论成功构建了稳定干扰KLF4基因表达的RAW264.7巨噬细胞株,KLF4下调能够明显抑制RAW264.7细胞增殖,促进细胞凋亡,增强细胞的吞噬活性。

短暂缺血再灌注对大鼠心肌Krppel样因子4表达的影响

目的观察大鼠心肌短暂缺血再灌注及相应的细胞氧化应激反应对Krppel样因子4表达的影响。方法采用短时间结扎及松解左冠状动脉前降支法构建大鼠心肌短暂缺血再灌注动物模型;采用过氧化氢(1mmol/L)处理C2C12肌原细胞法复制相应的氧化应激细胞模型;采用逆转录聚合酶链反应检测Krppel样因子4mR-NA的表达;采用蛋白免疫印迹法检测Krppel样因子4蛋白的表达。结果短暂缺血再灌注后,大鼠心肌组织中Krppel样因子4mRNA的水平明显增加;过氧化氢处理C2C12肌原细胞后,Krppel样因子4mRNA和蛋白的水平均明显增加。结论大鼠心肌短暂缺血再灌注及相应的细胞氧化应激反应均能显著诱导Krppel样因子4的高表达。

Krüppel样因子4对阿霉素诱导大鼠心肌细胞H_9C_2凋亡的影响

目的探讨阿霉素对大鼠心肌细胞H9C2凋亡的影响及Krppel样因子4过表达对阿霉素所致H9C2细胞凋亡的影响。方法采用台盼蓝染色检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Western blotting检测Krppel样因子4及凋亡相关基因多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的表达。结果阿霉素能够诱导H9C2细胞凋亡,采用5μmol/L阿霉素处理时,24h变化最为明显;Krppel样因子4过表达之后,细胞凋亡率较转空载体组更高,达87.90%。阿霉素能够诱导Krppel样因子4在H9C2细胞中表达增加;Krppel样因子4过表达组多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶裂解片段的表达水平明显上调。结论 Krppel样因子4能够促进阿霉素诱导的大鼠心肌细胞H9C2凋亡,其作用机制与多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶有关。

Krüppel样因子4在猪脂肪间充质干细胞成脂分化过程中的表达模式

目的探讨猪脂肪间充质干细胞(AMSCs)成脂分化过程中Krüppel样因子4(KLF4)的表达模式。方法采用F3代以上猪AMSCs进行成脂诱导分化,用油红O染色提取法检测成脂分化程度,用RT-PCR和Realtime PCR检测KLF4的表达模式。结果猪AMSCs成脂诱导分化,诱导3 d开始出现脂肪滴,诱导10 d时成脂分化率达60%;RT-PCR检测,在诱导分化2、4、8、12和16 d时都能检测出KLF4的表达;经Real-time PCR检测,上述各诱导分化时间点的表达量分别为对照组的1.6657±0.2269、2.6790±0.0524、2.6293±0.0280、2.3633±0.1568和2.6146±0.1575倍。这些结果表明,KLF4的表达在猪AMSCs成脂诱导分化的第2天就有显著上调,表达高峰出现在成脂分化的第4天,此后持续高表达。结论在猪AMSCs成脂分化过程中,从早期到晚期,KLF4发挥持续性的调控作用。