小麦Kr基因在小麦与玉米或鸭茅状摩擦禾杂交中的失活

用３７个小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）品种（系）为母本，分别与黑麦（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ）、球茎大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍｂｕｌｂｏｓｕｍ）、玉米（Ｚｅａｍａｙｓ）和鸭茅状摩擦禾（Ｔｒｉｐｓａｃｕｍｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）杂交，比较其亲和性，小麦和玉米或鸭茅状摩擦禾杂交比小麦与黑麦或球茎大麦杂交的亲和性显著提高。携带着显性Ｋｒ１和Ｋｒ２基因的小麦品种Ｈｏｐｅ与黑麦杂交，不能形成胚，而与玉米及鸭茅状摩擦禾杂交时，成胚率分别达１６．００％和３２．５０％。表明控制小麦与黑麦及球茎大麦杂交亲和性的Ｋｒ基因系统在小麦与玉米及小麦与鸭茅状摩擦禾属间杂交中失活。讨论了还存在有其它控制小麦属间杂交亲和性的遗传调控系统的可能性。

Kr1基因在小麦×玉米远缘杂交中的表达及甲基化变异

Kr1基因是小麦远缘杂交不亲和主效基因,为了解其表达及调控机制,本研究系统比较了小麦自花授粉和小麦×玉米远缘杂交两个过程中Kr1基因的表达差异,同时分析了这两个过程中Kr1基因部分序列的DNA甲基化状态。结果表明,Kr1基因在小麦自花授粉过程中始终处于低量表达或不表达状态,而在小麦×玉米远缘杂交过程中的表达呈动态变化,具体表现为授粉前低量表达,授粉后迅速大量表达,24h后又恢复为低量表达,高峰表达时期在外源花粉授入后0.5~2h左右。DNA甲基化分析显示,小麦自花授粉前后Kr1基因一直处于较高水平的甲基化状态,分别为58%和62%;而在授以玉米花粉后,Kr1基因迅速去甲基化,在0.5h内降到12%,在其后的1、2、24h内一直维持在10%~12%的低甲基化水平,表明DNA甲基化修饰参与了Kr1基因在小麦×玉米远缘杂交中的表达调控。

普通小麦显性Kr1和隐性kr1基因的分子结构差异

Kr1基因是小麦远缘杂交不亲和的主效基因。为探究Kr1基因的特性,根据已公布的Kr1基因c DNA部分序列,采用染色体步移(Genome Walking)和c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆小麦显性Kr1基因和隐性kr1基因,并进行序列分析。结果表明,小麦Kr1基因全长4 006 bp,含有4个外显子和3个内含子,ORF全长1 671 bp,编码557个氨基酸,可形成一条完整肽链,有基因活性,Kr1蛋白三级结构与植物S位点受体激酶具有较高的相似性。kr1基因全长3 945bp,第3、第4外显子中因含有大量终止密码子,不能通读,表明kr1基因无基因活性。同时对小麦×黑麦、小麦×球茎大麦、小麦×玉米等不同远缘杂交系统的亲和性差异进行探讨,认为Kr1基因在小麦×玉米中失活可能与玉米转座子的插入有关。本研究结果为进一步阐明Kr1基因的功能及其作用机制奠定了基础。

抗病基因KR3在大豆中的转化研究

采用农杆菌介导子叶节转化法将抗性基因KR3导入大豆中,共转化386个外植体,获得转基因生根苗15株,经草丁膦涂抹、Bar试纸条和PCR鉴定,最终获得12株KR3转基因阳性苗,农杆菌介导转化效率3.11%。RT-PCR结果显示转基因植株KR3基因表达量显著高于对照(非转基因植株);花叶病毒摩擦接种表明,转基因植株对花叶病毒能产生一定抗性,而非转基因植株则明显感病;摩擦接种三周后ELISA检测进一步表明在所检测的12株T1KR3转基因植株中未检测出SMV,而非转基因大豆植株SMV检出率为75%。研究结果表明,提高KR3基因的表达可以提高大豆的病毒抗性。

k_r基因在普通小麦-偃麦草双二倍体背景下的遗传表达分析

通过ＣＳ／Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ和ＣＳ／Ｔｈ．ｂｅｓａｒｂｉｃｕｍ两个双二倍体与黑麦和粘果山羊草的可杂交性，分析了中国春（ＣＳ）的隐性ｋｒ基因在普通小麦－偃麦草双二倍体下的遗传表达。结果表明，偃麦草种Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ和Ｔｈ．ｂｅｓａｒｂｉｃｕｍ中可能存在抑制ＣＳ隐性ｋｒ基因在普通小麦－偃麦草双二倍体中正常表达的遗传因子，其抑制效应因与普通小麦－偃麦草双二倍体杂交的父本不同而异。同时，Ｔｈ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ和Ｔｈ．ｂｅｓａｒｂｉｃｕｍ两个种中的抑制因子的抑制效应也存在差异。

小麦远缘杂交的珍贵种质沙丘小麦

在用普通小麦(Triticum aestivum L.)与兰州黑麦(Secale cereale cv lanzhou)杂交筛选具有可交配性基因(kr)品种中，发现普通小麦品种沙丘小麦(原产于日本)不仅具有kr基因和诱导部分同源染色体配对基因(ph)，而且与兰州黑麦杂交的第一代自然结实。这样的种质资源在小麦远缘杂交和品种改良中，具有十分重要的作用。

过表达KLF4重组质粒的构建及其在白血病K562细胞中的表达

为了构建过表达锌指转录因子Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因的重组质粒pEGFP-KLF4,观察其在白血病K562细胞中的表达,以RT-PCR法扩增人KLF4基因,构建pEGFP-KLF4重组质粒;经酶切及测序鉴定后,将pEGFP-KLF4质粒电穿孔转染白血病K562细胞(K562/pEGFP-KLF4组),设pEGFP-C1空质粒转染K562细胞(K562/pEGFP-C1组)及空白K562细胞作为对照,荧光显微镜观察EGFP-KLF4融合蛋白的表达情况,同时用抗生素G418筛选阳性克隆并扩大培养建立稳定过表达KLF4基因的K562细胞株,随后用RT-PCR检测3组K562细胞中KLF4的m RNA表达水平。实验结果显示,pEGFP-KLF4重组质粒构建成功。该质粒转染K562细胞24 h后能观察到较高强度的绿色荧光;经G418筛选出的阳性克隆扩大培养后建立了稳定过表达KLF4基因的K562细胞株;与对照组相比,K562/pEGFP-KLF4细胞组KLF4的m RNA表达水平明显升高,其过表达率为65.71%(P<0.05)。实验中构建的过表达KLF4基因的重组质粒pEGFP-KLF4能在K562细胞中高效表达,为进一步研究其在白血病中的作用奠定了基础。

表皮松解性掌跖角化症家系KRT9基因突变与临床表型分析

目的明确1个表皮松解性掌跖角化症(EPPK)家系的致病基因突变,为开展遗传咨询及产前诊断提供依据。方法收集家系内所有患者的临床表型资料,并采集血样提取基因组DNA,采用包含表皮松解性掌跖角化症相关基因的二代测序Panel结合Sanger测序验证的方法检测该家系的基因突变。结果该家系所有患者均在KRT9基因检测到c.1373T>C(p.Leu458Pro)的杂合突变,该突变位于角蛋白9(K9)高度保守的螺旋2B区,该家系患者均未出现已有报道中检测到该突变患者存在的指节垫和先天性指屈曲症状。结论 KRT9基因c.1373T>C(Leu458Pro)的杂合突变为本研究中EPPK的遗传学病因,同一突变在不同家系或不同个体之间的临床表型存在差异。