橙色红曲菌Ku70基因缺失菌株的构建及功能分析

红曲菌作为传统的药食同源微生物,可产生多种有益的代谢产物,如:红曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸等。构建基因工程菌是研究红曲菌代谢途径的有效方法,同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)被认为是丝状真菌DNA双链断裂(DSB)修复的两种主要途径。有研究表明,抑制NHEJ中关键成分的活性通常会提高目的基因的同源重组效率。我们在橙色红曲菌(Monascus aurantiacus)AS3.4384中发现了参与NHEJ途径的Ku70蛋白。通过农杆菌介导的同源重组法成功敲除Ku70基因,发现不影响红曲菌的生长繁殖\\产孢能力以及色素的生物合成,因此可构建Ku70基因缺失菌株作为红曲菌高效基因敲除体系,为后续的基因敲除提供研究材料。

Ku70基因导入人肺癌细胞后的表达及意义

目的 :研究Ku70基因导入人肺癌细胞 (LCA)后的表达及意义。方法 :构建重组的正义和反义Ku70基因表达质粒载体分别导入LCA细胞。结果 :用Northern印迹杂交法证明Ku70正义、反义基因均可在LCA的mRNA中得到表达 ,用West ern blotting法去证明细胞中只有导入正义Ku70基因的蛋白表达 ,而导入反义Ku70基因的人肺癌细胞 ,无正义Ku70蛋白表达 ,结论 :正义Ku70基因的表达可以调节DNA的修复 ,反义Ku70基因的表达可以增强肿瘤细胞对放射线照射的敏感性。

沉默Ku70后人耐药肺癌细胞凋亡基因组表达变化及临床意义

目的:探讨沉默Ku70(siRNA-Ku70)后人耐药肺腺癌(A549DDP)细胞系凋亡基因组表达变化及临床意义。方法:应用RT-PCR方法比较Ku70mRNA在人肺腺癌A549细胞系及其耐药肺癌A549DDP细胞系的表达水平;应用PCR-Array方法比较沉默Ku70前后A549DDP细胞凋亡基因组表达水平变化。结果:Ku70mRNA在A549DDP细胞系表达水平显著高于A549细胞系;沉默Ku70后A549DDP细胞促凋亡基因组中BAX、TP53、TP73等呈高表达,抗凋亡基因BFAR及具有双向调节功能的凋亡基因肿瘤坏死因子受体家族成员(TNFRSF 1A)呈低表达(P<0.05)。结论:Ku70mRNA在人耐药非小细胞肺癌细胞系呈现高表达;提示Ku70参与非小细胞肺癌耐药的发生;封闭Ku70可改变耐药肺癌细胞的促/抗凋亡基因组的表达呈促细胞凋亡效应,提示Ku70可能作为上游调控点参与调控部分促/抗凋亡基因组的表达,通过促凋亡表达效应而逆转细胞耐药。

RNA干扰Ku70基因对宫颈癌Hela细胞放射敏感性影响的实验研究

目的观察ku70基因短干扰RNA(siRNA)对宫颈癌Hela细胞放射敏感性的影响。方法采用集落形成技术测定不同剂量射线照射对Hela细胞存活率的影响,观察Hela细胞对射线照射的敏感性。采用时定量PCR技术(quantitiv real time PCR,QRT-PCR)检测Ku70 mRNA水平表达。采用Western Blot免疫印记技术检测Ku70蛋白表达。采用RNA干扰(RNAi)技术抑制Hela细胞中Ku70蛋白的表达,观察Ku70蛋白表达下调对Hela细胞放射敏感性的影响。采用集落形成技术测定4.0 Gy射线照射对Hela细胞存活率的影响。进而分析Hela细胞对射线的放射敏感性。结果宫颈癌Hela细胞对1.0-4.0 Gy射线照射不够敏感,有相当高的辐射抗性。量效实验证实,1.0-6.0 Gy射线照射后,HeLa细胞中Ku70 mRNA及Ku70蛋白表达均明显增高。时效实验证实,4.0 Gy射线照射后8 h-72 h,HeLa细胞中Ku70 mRNA及Ku70蛋白表达均明显增高。本实验成功的构建了Ku70基因RNA干扰载体pSilencer-4.1-Ku70,稳定转染HeLa细胞后,有效抑制Ku70蛋白的表达。稳定转染pSilencer-4.1-Ku70干扰质粒并抑制Ku70蛋白表达后,HeLa细胞对射线照射的放射敏感性显著增高(P<0.001)。结论 Ku70 siRNA有效下调Ku70 mRNA水平,抑制Ku70蛋白的表达,可明显提高Hela细胞对辐射的敏感程度。本研究结果还提示,Ku70基因可作为衡量宫颈腺癌辐射敏感性指标,为临床合理筛选患者进行放疗、预测放疗疗效提供一条适用途径。

Ku70基因RNA干扰载体的构建及干扰效果鉴定

目的构建靶向Ku70基因的RNA干扰(RNAi)表达载体并进行RNAi效果鉴定。方法设计3个针对Ku70基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染Hela细胞系。在转染24、48、72 h后,通过免疫印迹分析检测Ku70蛋白的表达量。把RNAi效果最显著的siRNA设计成短发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA),克隆入pSi-lencerTM 4.1-CMV hygro载体,转染Hela细胞系并筛选稳转细胞株,在mRNA和蛋白水平,评估Ku70 siRNA的干扰效果。结果 siRNA转染Hela细胞24、48 h后,Ku70蛋白的表达没有显著变化,但在72 h后,蛋白的表达量显著下降。在具有稳定表达siRNA的稳转细胞株中,Ku70基因的表达在mRNA水平和蛋白水平都受到了非常明显的抑制。结论成功构建靶向Ku70基因RNAi载体,并筛选出效能最优序列,为进一步研究Ku70基因的表达与宫颈癌放射治疗敏感性的关系奠定了基础。

Ku70基因稳定敲除HeLa细胞株的建立及其生物学功能研究

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建人Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株,并检测其生物学功能。方法:设计并构建向导RNA载体p Cas-g RNA和同源重组供体DNA载体p Back Zero-T-Ku70,2种重组质粒共转染HeLa细胞,加入潮霉素B进行抗性筛选,通过基因组PCR和Western印迹检验Ku70基因是否被敲除;进而,选择Ku70稳定敲除的细胞株,分别采用CCK-8和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力;此外,提取细胞总RNA,反转录成c DNA后用荧光定量PCR仪检测5种miRNA(hsa-miR-649、hsa-miR-544a、hsa-miR-562、hsa-miR-548a、hsa-miR-492)的表达水平。结果:g RNA表达质粒p Cas-g RNA和DNA供体质粒p Back Zero-T-Ku70构建成功;2种重组质粒共转染HeLa细胞,基因组PCR扩增出特异的基因重组DNA片段,Western印迹结果显示Ku70蛋白已基本无表达。细胞增殖和迁移实验显示敲除Ku70基因的HeLa细胞增殖和迁移能力均有所减弱。q RT-PCR结果显示,敲除Ku70基因致hsa-miR-649、hsa-miR-544a和hsa-miR-562水平有所升高,而hsa-miR-548a和hsa-miR-492水平未有明显变化。结论:获得Ku70基因稳定敲除的细胞株;Ku70蛋白可能参与了HeLa细胞增殖和迁移过程;其还可能调节部分miRNA的表达。

不同小麦基因型对γ射线辐照敏感性的分子解析

本研究以63份小麦品种(系)的风干种子为材料,分别利用0 Gy、100 Gy、150 Gy和250 Gy剂量的60Coγ射线辐照,通过种子发芽试验和基因表达等方法,探讨不同小麦基因型间辐射敏感性差异及辐射敏感性相关基因的表达模式。结果表明:根据苗高损伤效应,将63份不同小麦基因型分为敏感型(核优1号、中优206和太原703等)、较敏感型(旱选10号、济麦20和中麦175等)、较钝感型(德抗961、豫麦68和淮麦20等)和钝感型(衡观136、邯6172和偃展4110等)4类。所选材料γ射线辐照后,敏感型基因型中Ta Ku70和Ta Ku80基因诱导表达明显,钝感型基因型中Ta Ku70和Ta Ku80基因诱导表达不明显。本研究表明不同小麦基因型间辐射敏感性差异明显且与Ta Ku70和Ta Ku80基因表达模式有关。

DNA依赖蛋白激酶在肝胆肿瘤组织中的表达

目的 本研究旨在通过检测不同类型肝胆肿瘤组织中DNA-PKcs和Ku70的表达水平，探讨其与肿瘤恶性程度和浸润性的关系。方法 通过免疫组化SP法检测36例肝胆肿瘤组织和部分癌旁组织中DNA-PKcs和Ku70蛋白的表达状况。结果 Ku70普遍表达于所检测的肿瘤组织中，其中腺癌和部分腺瘤表达最高，但与肿瘤的恶性程度和转移特性漫有明显的关系。而DNA-PKcs表达在不同类型肿瘤间存在明显的差异，肝细胞癌表达最高，胆管或胆囊腺癌次之，乳头状腺瘤或胆管腺瘤不表达或微弱表达，但伴有非典型增生或浸润转移时，DNA-PKcs表达明显上升。癌旁组织不表达DNA-PKcs。结论 DNA-PKcs表达水平与肿瘤类型、恶性程度和转移或浸润特性有相关性，有可能成为肝胆肿瘤组织区别于正常组织的一个新的生物标记物。

竹黄菌Ku70基因全长克隆及序列分析

为构建竹黄菌高效敲除载体,以利于竹黄菌基因功能及竹黄菌与寄主竹子之间的相互关系的研究,利用RT-PCR(reverse transcriptase-PCR)及RACE(rapid amplification of c DNA ends)技术克隆获得Ku70基因全长序列,命名为s Ku70。序列分析显示:该序列基因全长为2 306 bp,开放阅读框长度为1 974 bp,编码657个氨基酸,分子质量为73.940 5 k D,理论等电点p I为5.58;序列同源性分析表明:该基因序列和预测的蛋白序列与小麦叶枯病菌SN15(Phaeosphaeria nodorum SN15)的Ku70 m RNA序列(XM_001803174.1)及ATP依赖的DNA解旋酶亚基Ⅱku70(Q0U5F2.1)同源性最高,identity分别75%和78%。二级结构预测表明Ku70蛋白α-螺旋(alpha helix)占36.99%,延伸链(extended strand)占17.05%,无规卷曲(random coil)占36.23%;包含一个Ku-core domain、一个Von Willebrand factor type A(v WA)domain和一个SAP domain,为亲水蛋白;并利用同源模建的方法预测了其三级结构。

CRISPR/Cas13系统敲减HEK293T细胞ku70和lig4基因表达

成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)系统是目前基因编辑、基因表达研究的热点,其中靶向RNA的CRISPR/Cas13系统的开发为RNA的干扰和编辑提供了新的方向。文中针对HEK293T细胞非同源末端连接(Nonhomologousendjoining,NHEJ)通路修复关键因子Ku70和Lig4的编码序列,设计并合成CRISPR/Cas13a、b系统相应的gRNA,检测其对ku70和lig4基因表达的影响。结果显示,Cas13a对ku70和lig4的RNA敲减效果可以达到50%以上,Cas13b对ku70和lig4的RNA敲减效果分别达到92%和76%;同时Cas13a、b系统能将Ku70和Lig4蛋白水平分别下调至68%和53%。CRISPR/Cas13系统可有效敲减HEK293T细胞RNA和蛋白质表达,为基因功能和调控研究提供一种新的策略。