橙色红曲菌Ku70基因缺失菌株的构建及功能分析

红曲菌作为传统的药食同源微生物,可产生多种有益的代谢产物,如:红曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸等。构建基因工程菌是研究红曲菌代谢途径的有效方法,同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)被认为是丝状真菌DNA双链断裂(DSB)修复的两种主要途径。有研究表明,抑制NHEJ中关键成分的活性通常会提高目的基因的同源重组效率。我们在橙色红曲菌(Monascus aurantiacus)AS3.4384中发现了参与NHEJ途径的Ku70蛋白。通过农杆菌介导的同源重组法成功敲除Ku70基因,发现不影响红曲菌的生长繁殖\\产孢能力以及色素的生物合成,因此可构建Ku70基因缺失菌株作为红曲菌高效基因敲除体系,为后续的基因敲除提供研究材料。

Ku70基因导入人肺癌细胞后的表达及意义

目的 :研究Ku70基因导入人肺癌细胞 (LCA)后的表达及意义。方法 :构建重组的正义和反义Ku70基因表达质粒载体分别导入LCA细胞。结果 :用Northern印迹杂交法证明Ku70正义、反义基因均可在LCA的mRNA中得到表达 ,用West ern blotting法去证明细胞中只有导入正义Ku70基因的蛋白表达 ,而导入反义Ku70基因的人肺癌细胞 ,无正义Ku70蛋白表达 ,结论 :正义Ku70基因的表达可以调节DNA的修复 ,反义Ku70基因的表达可以增强肿瘤细胞对放射线照射的敏感性。

RNA干扰Ku70基因对宫颈癌Hela细胞放射敏感性影响的实验研究

目的观察ku70基因短干扰RNA(siRNA)对宫颈癌Hela细胞放射敏感性的影响。方法采用集落形成技术测定不同剂量射线照射对Hela细胞存活率的影响,观察Hela细胞对射线照射的敏感性。采用时定量PCR技术(quantitiv real time PCR,QRT-PCR)检测Ku70 mRNA水平表达。采用Western Blot免疫印记技术检测Ku70蛋白表达。采用RNA干扰(RNAi)技术抑制Hela细胞中Ku70蛋白的表达,观察Ku70蛋白表达下调对Hela细胞放射敏感性的影响。采用集落形成技术测定4.0 Gy射线照射对Hela细胞存活率的影响。进而分析Hela细胞对射线的放射敏感性。结果宫颈癌Hela细胞对1.0-4.0 Gy射线照射不够敏感,有相当高的辐射抗性。量效实验证实,1.0-6.0 Gy射线照射后,HeLa细胞中Ku70 mRNA及Ku70蛋白表达均明显增高。时效实验证实,4.0 Gy射线照射后8 h-72 h,HeLa细胞中Ku70 mRNA及Ku70蛋白表达均明显增高。本实验成功的构建了Ku70基因RNA干扰载体pSilencer-4.1-Ku70,稳定转染HeLa细胞后,有效抑制Ku70蛋白的表达。稳定转染pSilencer-4.1-Ku70干扰质粒并抑制Ku70蛋白表达后,HeLa细胞对射线照射的放射敏感性显著增高(P<0.001)。结论 Ku70 siRNA有效下调Ku70 mRNA水平,抑制Ku70蛋白的表达,可明显提高Hela细胞对辐射的敏感程度。本研究结果还提示,Ku70基因可作为衡量宫颈腺癌辐射敏感性指标,为临床合理筛选患者进行放疗、预测放疗疗效提供一条适用途径。

Ku70基因RNA干扰载体的构建及干扰效果鉴定

目的构建靶向Ku70基因的RNA干扰(RNAi)表达载体并进行RNAi效果鉴定。方法设计3个针对Ku70基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染Hela细胞系。在转染24、48、72 h后,通过免疫印迹分析检测Ku70蛋白的表达量。把RNAi效果最显著的siRNA设计成短发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA),克隆入pSi-lencerTM 4.1-CMV hygro载体,转染Hela细胞系并筛选稳转细胞株,在mRNA和蛋白水平,评估Ku70 siRNA的干扰效果。结果 siRNA转染Hela细胞24、48 h后,Ku70蛋白的表达没有显著变化,但在72 h后,蛋白的表达量显著下降。在具有稳定表达siRNA的稳转细胞株中,Ku70基因的表达在mRNA水平和蛋白水平都受到了非常明显的抑制。结论成功构建靶向Ku70基因RNAi载体,并筛选出效能最优序列,为进一步研究Ku70基因的表达与宫颈癌放射治疗敏感性的关系奠定了基础。

Ku70基因稳定敲除HeLa细胞株的建立及其生物学功能研究

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建人Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株,并检测其生物学功能。方法:设计并构建向导RNA载体p Cas-g RNA和同源重组供体DNA载体p Back Zero-T-Ku70,2种重组质粒共转染HeLa细胞,加入潮霉素B进行抗性筛选,通过基因组PCR和Western印迹检验Ku70基因是否被敲除;进而,选择Ku70稳定敲除的细胞株,分别采用CCK-8和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力;此外,提取细胞总RNA,反转录成c DNA后用荧光定量PCR仪检测5种miRNA(hsa-miR-649、hsa-miR-544a、hsa-miR-562、hsa-miR-548a、hsa-miR-492)的表达水平。结果:g RNA表达质粒p Cas-g RNA和DNA供体质粒p Back Zero-T-Ku70构建成功;2种重组质粒共转染HeLa细胞,基因组PCR扩增出特异的基因重组DNA片段,Western印迹结果显示Ku70蛋白已基本无表达。细胞增殖和迁移实验显示敲除Ku70基因的HeLa细胞增殖和迁移能力均有所减弱。q RT-PCR结果显示,敲除Ku70基因致hsa-miR-649、hsa-miR-544a和hsa-miR-562水平有所升高,而hsa-miR-548a和hsa-miR-492水平未有明显变化。结论:获得Ku70基因稳定敲除的细胞株;Ku70蛋白可能参与了HeLa细胞增殖和迁移过程;其还可能调节部分miRNA的表达。

竹黄菌Ku70基因全长克隆及序列分析

为构建竹黄菌高效敲除载体,以利于竹黄菌基因功能及竹黄菌与寄主竹子之间的相互关系的研究,利用RT-PCR(reverse transcriptase-PCR)及RACE(rapid amplification of c DNA ends)技术克隆获得Ku70基因全长序列,命名为s Ku70。序列分析显示:该序列基因全长为2 306 bp,开放阅读框长度为1 974 bp,编码657个氨基酸,分子质量为73.940 5 k D,理论等电点p I为5.58;序列同源性分析表明:该基因序列和预测的蛋白序列与小麦叶枯病菌SN15(Phaeosphaeria nodorum SN15)的Ku70 m RNA序列(XM_001803174.1)及ATP依赖的DNA解旋酶亚基Ⅱku70(Q0U5F2.1)同源性最高,identity分别75%和78%。二级结构预测表明Ku70蛋白α-螺旋(alpha helix)占36.99%,延伸链(extended strand)占17.05%,无规卷曲(random coil)占36.23%;包含一个Ku-core domain、一个Von Willebrand factor type A(v WA)domain和一个SAP domain,为亲水蛋白;并利用同源模建的方法预测了其三级结构。

鼻咽癌变过程基因组稳定与修复基因表达

[目的]研究鼻咽癌变过程中基因组稳定与修复基因的表达情况。[方法]在鼻咽癌高发区,选择鼻咽炎、鼻咽癌前病变及鼻咽癌患者的鼻咽组织作为研究对象,TRIZOL试剂抽提RNA,cRNA标记与合成、基因组稳定和DNA修复基因芯片(Oligo Genome Stability & DNARepair Microarray,美国SuperArray公司,CatalogNo.OHS-042)杂交,化学发光检查及图像采集和数据分析。[结果]在基因组稳定和DNA修复基因芯片128个基因中,对比于鼻咽炎患者,上调3倍以上的基因鼻咽癌前病变者有14个基因,鼻咽癌有8个基因,无下调1倍以上的基因;对比于鼻咽癌前病变者,上调3倍以上的基因鼻咽癌有14个,无下调1倍以上的基因。乳腺癌易感基因2、Ku70结合蛋白3基因在鼻咽癌变过程中呈现高表达。[结论]在鼻咽癌变过程中,基因组稳定与修复基因多表现为上调表达,下调表达很少。