大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体的制备与鉴定

为制备免疫学特性良好的大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子(Kunitz trypsin inhibitor,KTI)单克隆抗体,以50μg/只的免疫剂量将KTI免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定多抗血清效价和敏感性,选择血清效价和敏感性较优的小鼠进行细胞融合,多次筛选得到稳定分泌KTI单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株,采用体内诱生腹水法制备mAb并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,1号小鼠经免疫后效价最高且敏感性最好,半数抑制浓度(IC50)为157.33ng/mL,经细胞融合筛选得到4E6-E9阳性杂交瘤细胞株,所制备的抗体效价达到1:1 638 400,亚型为IgG1型,亲和常数为1.45×108 L/mol,IC50为28.39ng/mL,且特异性强。说明试验所制备的mAb免疫学特性良好,能够为建立灵敏、特异的KTI免疫学检测方法提供良好的抗体保障。

Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的研究进展

Kunitz型胰蛋白酶抑制剂属于典型丝氨酸蛋白酶抑制剂,其生理功能至少包括了保护储存蛋白、调节内源蛋白酶的活性、保护个体免受昆虫和病原体的侵害、抑制癌细胞侵袭扩散、抗炎、抗真菌等作用。并已经应用到了抗虫性转基因植物和临床疾病治疗中。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(SKTI)研究进展

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂 (SKTI)是一种典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂 ,主要集中在大豆的子叶中。近 60年来 ,对其生化特性及结构已有较多研究 ,通常认为这种蛋白酶抑制剂具有贮藏、调节内源蛋白酶活性及植物防御等作用。研究表明 ,这种蛋白酶抑制剂抗虫谱广 ,能显著抑制幼虫的生长发育不易产生抗性 ,对人畜无害 ,因此对其进行研究及开发利用具有重要的经济和社会效益。迄今为止 ,至少已有 4种基因被克隆 ,通过转基因技术在烟草、水稻、小麦等作物获得了抗性植株 .本文从SKTI的类型、基因克隆及生理功能等方面作一简单综述。

偏重亚硫酸钠钝化生豆粕胰蛋白酶抑制因子的研究

试验用不同浓度的Ｎａ＿２Ｓ＿２Ｏ＿５处理生豆粕，进行适宜水平研究。结果表明，当生豆粕ＴＩＡ和ＵＡ分别为２９．７２酶活单位和１．９０ＡｐＨ时，分别用０．３％、０．４％、０．５％和０．６％Ｎａ＿２Ｓ＿２Ｏ＿５处理ＲＳＢＭ，ＴＩＡ依次降低了５ｌ．８％、５５．９６％、５９．８３％和５２．０５％，均极显著地低于ＲＳＢＭ（Ｐ＜０．０１）。０．３％Ｎａ＿２Ｓ＿２Ｏ＿５对ＵＡ无影响，其它处理ＵＡ提高约０．０６ＡｐＨ。生豆粕日粮显著抑制内用仔鸡生长，使生产性能下降，胰腺极显著肿大（比熟豆粕大１倍），腹脂率提高，十二指肠液蛋白酶活性下降，日粮粗蛋白质真实利用率降低。用０．４～０．６％Ｎａ＿２Ｓ＿２Ｏ＿５处理生豆粕饲喂肉仔鸡，肉鸡胰腺肿大得到明显缓解（Ｐ＜０．０１），增重、饲料报酬、十二指肠液蛋白酶活性及粗蛋白质真实利用率各项指标均显著提高，然而各组试验鸡肝脏相对重量无明显差异，肉眼观察未见明显病变。以综合指数Ｙ为总指标，依据相关系数的性质，以生豆粕为对照，综合体重（Ｘ＿１）、胰腺相对重量（Ｘ＿２）、豆粕ＴＩＡ（Ｘ＿３）和粗蛋白质真实利用率（Ｘ＿４）的相对值为一体，比较评价各Ｎａ＿２Ｓ＿２Ｏ＿５浓度处理生豆粕的效果。结果表明，当?

缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶2.3的大豆新品种——中黄16的选育

大豆新品种中黄 16 (原名中作 96 - 95 2 ) ,是中国农业科学院作物育种栽培研究所利用缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂的高产、优质、抗花叶病毒病 (SMV)的高代材料ti15 176作母本 ,美国引进优良品种Century近等基因系、脂肪氧化酶缺失的优质材料Century - 2 3作父本进行有性杂交 ,采用未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native PAGE)技术及等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳 (IEF PAGE)技术 ,对杂种后代胰蛋白酶抑制剂 (Ti)、脂肪氧化酶 (Lox)进行缺失检测及多年辅助选择育成。该品种于 1999～ 2 0 0 0年参加北京市夏播大豆区域试验 ,2 0 0 1年参加北京市夏播大豆生产试验 ,2 0 0 2年 4月通过北京市品种审定委员会审定。其突出特点是高产、稳产、优质 (蛋脂双高、蛋白质含量高且蛋白质品质优异———缺失Ti和Lox2 3)、抗花叶病毒病、综合性状优异。是国内第一个缺失Kunitz胰蛋白酶抑制且缺失脂肪氧化酶 2 3的三缺 (Lox 2 3,ti)优质大豆新品种。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂新类型Tid的全序列分析

It was widely thought that 3 variants of Kunitz type trypsin inhibitor(SBTi A 2) existed in soybean seed storage protein.Three of codominant alleles Ti a,Ti b and Ti c were identified to decode these SBTi A 2 inhibitors and the amino acid sequences of them were determined,of which one or more different amino acid were found.Ti d was a new variant allele of SBTi A 2 discovered after analyzing more than 15 000 samples of soybean seed in China.In order to study the structure features of Ti d protein,the amino acid sequence of this protein was deduced from its coding region which was amplified by PCR from soybean genomic DNA and sequenced.By comparison with Ti a protein,two different amino acid residue were found between Ti a and Ti d proteins.One was an extra Ala inserted in the signal peptide of Ti d,with 8 residues from N terminal,and the other existed in the mature protein,with Glu 69 in Ti a protein turned into Lys 69 in Ti d protein.The amino acid sequence of Ti d mature protein was also different from those of Ti a and Ti b.

大豆胰蛋白酶抑制因子的研究进展

大豆胰蛋白酶抑制因子是大豆中的主要抗营养因子,是一种多肽类或蛋白质。该文对大豆胰蛋白酶抑制因子的种类,Kunitz型胰蛋白酶抑制因子和Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制因子的结构和特性,大豆胰蛋白酶抑制因子的功能及提取纯化方法进行了综述,旨在为大豆胰蛋白酶抑制因子的进一步开发和利用提供参考。

生豆粕胰蛋白酶抑制因子对肉用仔鸡生长发育的影响

选用一日龄ＡｒｂｏｒＡｃｒｅｓ（ＡＡ）商品代雏鸡１８０只进行饲养试验和屠宰试验，研究生豆粕日粮对肉用仔鸡生长发育、敏感性内脏组织及十二指肠蛋白酶活性的影响。结果表明：生豆粕尿酶和胰蛋白酶抑制因子（ＴＩ）活性分别达到１．９３ΔｐＨ和３３．９酶活性单位，极显著抑制肉用仔鸡生长发育（Ｐ＜０．０１），使胰腺显著肿大（Ｐ＜０．０１），细胞体积扩大，单位面积细胞数减少。对肝脏重量及其组织学结构无明显影响。生豆粕中ＴＩ显著降低十二指肠蛋白酶活性（Ｐ＜０．０１）及日粮蛋白质的消化率。在生豆粕日粮中添加蛋氨酸，其对内仔鸡的抑制作用及对胰脏的损伤不能得到显著补偿。

多年生野生大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及分析

利用RT-PCR方法,从对蚜虫高抗的多年生野生大豆短绒野大豆(G.tomentella)(2n=78)未成熟子叶中扩增到了大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂同源基因单一目的片段,该基因和蛋白分别被命名为KTiPW54和KTiPW54。序列分析表明:该片段为654 bp的完整编码序列,编码218个氨基酸残基,编码的蛋白与栽培大豆(G.max)、野生大豆(G.soja)、短绒野大豆(G.tomentella)的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因编码蛋白高度保守的区域一致。将KTiPW54编码区克隆到表达载体pTWIN1,在宿主菌BL21(DE3)中经IPTG诱导获得高效表达。

大豆胰蛋白酶抑制因子的危害及其检测研究进展

大豆胰蛋白酶抑制因子是大豆中一类主要的抗营养因子,其主要危害表现在致使胰腺增生、肿大以及抑制动物生长等方面。近年来,针对大豆胰蛋白酶抑制因子的检测方法已成为研究热点。文章通过对大豆胰蛋白酶抑制因子的危害和现有的检测方法进行综述,旨在为大豆及其制品中胰蛋白酶抑制因子的监控以及建立大豆胰蛋白酶抑制因子快速、高效的检测方法提供参考。

大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化

以脱脂豆粉为原料,经pH7.6磷酸溶液抽提、65℃热变性、硫酸铵分步沉淀等提取技术制备粗提液,之后再经过DEAE-52离子交换、亲和层析和葡聚糖凝胶过滤等纯化技术研究大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化方法。结果表明,从脱脂豆粉中分离纯化的大豆胰蛋白酶抑制因子的比活力高达4 600 U.mg-1,提纯倍数为73.85。纯化的大豆胰蛋白酶抑制因子经SDS-PAGE电泳分析,呈现2条谱带,分子量分别为21.92和20.04 kDa,这2种蛋白均为大豆胰蛋白酶抑制因子。该法操作简便,分离纯化效果好,对大豆胰蛋白酶抑制因子的研究与生产有重要的参考价值。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因RNAi载体的构建

采用PCR技术扩增得到胰蛋白酶抑制剂KTi基因正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GUS基因片段,将其分别连入克隆载体pMD18-TVector中。然后以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,通过AHLG作为中间载体,根据RNAi原理将组成RNAi结构的4个目的片段分别连入其中,成功构建了种子特异性RNAi表达载体p1301-KTiRi。研究结果为RNAi技术在大豆品质改良中的应用提供了基础。

Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失大豆新品系培育及其饲草价值分析

大豆作为饲料蛋白质的重要来源,既含有丰富的营养成分,也有影响蛋白质消化吸收的胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子。本研究以合丰50为母本,中黄16为父本,通过常规杂交育种及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子辅助育种技术,经过多年选育,获得适合黑龙江省栽培的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失稳定遗传的大豆新品系“HZ8009”。该品系生育期120 d,植株高大茎叶繁茂,无限结荚习性,籽粒蛋白质含量42%,脂肪含量20%。利用饲草质量检测技术对高代品系“HZ7009”植株饲草营养价值分析表明,与牡丹江秣食豆相比,“HZ7009”干草产量高21.39%,干物质中粗蛋白质含量高3.92%,且最佳刈割时期为花期至结荚期。大豆新品系“HZ8009”具有高蛋白、高生物量的特性,可作饲草资源品种加以广泛利用。

肉仔鸡对胰蛋白酶抑制因子的耐受性研究

给15日龄AA肉仔鸡分别饲喂胰蛋白酶抑制因子(TI)9 01 ,6 45 ,3 74 ,1 80 ,1 39 ,0 34g/kg 的日粮至35d。肉仔鸡对饲粮中胰蛋白酶抑制因子的耐受性阈值为3 74g/kg。

大豆中胰蛋白酶抑制因子的生化性质和抗营养作用

生大豆中含有许多抗营养因子影响其营养价值与利用效果,其中最主要的是胰蛋白酶抑制因子。本文总结了大豆中两大类胰蛋白酶抑制因子,即Kunitz类和Bowman-Birk类抑制因子的主要生化性质,以及含大豆胰蛋白酶抑制因子的日粮对不同种类动物的饲喂效果和生理反应。另外还介绍了胰腺分泌的蛋白酶与抑制因子的识别与反应机理,以及大豆胰蛋白酶抑制因子阻碍动物生长和引起胰腺增大的作用方式。最后讨论了在研究胰蛋白酶抑制因子的抗营养作用时,需要注意的几个问题。

大豆胰蛋白酶抑制因子酶联免疫吸附测定方法的研究

本研究以纯化的大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子（KTI）为抗原，对兔子进行35天免疫得到了兔抗KTI血清。分别用辣根过氧化物酶（HRP）标记纯化的抗原与抗体，制备了标记适度的酶标抗原与酶标抗体。建立了3种检测KTI含量的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，即酶标抗原竞争、酶标抗体直接抑制和问接抑制法。结果表明，抑制率在20％～70％范围之内，3种方法得到的标准曲线均呈现良好的线性关系（r＞0．96），且检测下限均低于20ng／ml。根据得到的标准曲线，用酶标抗原竞争ELISA法测定了不同温度热处理的KTI中剩余活性部分的含量。结果表明，ELISA法与酶化学分析法的测定结果高度相关（r＝0．99），同时样品添加的回收率试验误差小于10％。酶标抗原竞争法还被用来测定了不同温度热处理的大豆和熟豆粕、全价饲料等几种大豆产品中KTI的含量。以上结果说明，用ELISA法检测生大豆和不同热加工形式的大豆产品中的剩余KTI含量是可行的。

大豆胰蛋白酶抑制因子对獭兔胰腺组织学结构的影响

选择（42±4）日龄、平均体重为（711.4±108.8）g的健康美系獭兔断奶幼兔30只,公母比例为1∶1,根据性别、体重,将30只兔随机分为3组,每组10只,公母各半,单笼饲养。3个组日粮为等能等蛋白质设计,日粮中分别含有25%生大豆、25%化学钝化大豆、25%豆粕。胰蛋白酶抑制因子含量（实测值）分别为6.55、1.99和0.81 mg/g。试验6周后,从每一个组中随机选出3只公兔进行屠宰（（91±4）日龄、平均体重为1544.2 g±114.8 g）,宰前空腹46 h,取胰腺样品在10%中性甲醛液中固定,常规石蜡切片,HE染色,用于光学显微镜组织学观察。电子显微镜观察样品用2.5%戊二醛固定,常规树脂包埋,超薄切片,铀—铅染色。光学显微镜对胰腺组织结构观察结果表明,25%生大豆组幼兔胰腺间纤维性结缔组织增生,叶间水肿,局部腺组织消失,细胞水肿,边界模糊。电子显微镜对胰腺细胞观察结果表明,生大豆组幼兔的胰腺细胞核不规则,线粒体水肿,嵴消失,局部膜破裂,内质网减少,分泌颗粒极少或消失。25%生大豆组獭兔胰腺组织结构发生异常变化,而豆粕组和化学钝化大豆组正常。

大豆胰蛋白酶抑制因子对獭兔氮平衡和养分消化率的影响

试验选择(63±4)日龄、平均体重为(1150.5±124.0)g的健康美系獭兔20只,随机分为5组,每组4只兔,公母各半。试验日粮分别含有25%生大豆、25%化学钝化大豆、25%热处理大豆、25%豆粕和13%生大豆+12%豆粕。胰蛋白酶抑制因子含量(实测值)分别为6.55、1.99、1.73、0.81和3.97 mg/g。试验结果表明,25%生大豆组显著降低饲料氮表观消化率(P<0.05),显著增加粪氮排出(P<0.05),对尿氮无显著影响;化学钝化、热处理及生大豆+豆粕组粪氮、氮消化率同豆粕组间无显著差异(P>0.05)。饲料干物质、有机物质、无氮浸出物、粗脂肪、粗纤维表观消化率5组间无显著差异(P>0.05)。

日粮中胰蛋白酶抑制因子对鸡胰腺的影响

344只AA肉仔鸡分别从15日龄和35日龄开始饲喂胰蛋白酶抑制因子含量不同的日粮至49日龄 ,以观察胰蛋白酶抑制因子对不同年龄阶段和不同饲喂期的肉仔鸡胰腺重和组织学的影响。150只伊莎褐蛋用公雏在不同时期屠宰 ,以探讨胰腺随饲喂时间的变化规律。结果表明 :肉仔鸡胰腺相对重与日粮中胰蛋白酶抑制因子浓度呈明显的剂量依赖关系 ,日粮中胰蛋白酶抑制因子浓度为1.97～0.20 %时胰腺未出现明显变化 ,年龄和饲喂期长短对肉仔鸡胰腺影响不大。胰腺对胰蛋白酶抑制因子反应迅速 ,且这种代偿反应在日粮胰蛋白酶抑制因子降低到0.19

α1-抗胰蛋白酶和组织因子途径抑制物基因多态性的交互作用及其与大肠癌侵袭和转移的关系

目的:探讨α1-抗胰蛋白酶(α1-antitypsin,α1-AT)基因第5外显子和组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)基因T287C多态性的交互作用及其与大肠癌侵袭和转移的关系。方法:选择河南省新乡医学院第一附属医院2011年7月至2015年7月期间收治的经病理学确诊的大肠癌TNMⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者各180例,以180例TNM 0期患者作为对照组,用PCR-RFLP技术检测各组患者外周血白细胞两基因的多态性,以Hardy-Weinberg平衡检验分析样本的群体代表性,以Khoury和Wagener模型分析两基因多态性的交互作用。ELISA法检测患者血清α1-AT和TFPI蛋白表达,细胞划痕试验和Transwell侵袭试验分别检测α1-AT和TFPI对人结肠癌SW480细胞迁移和侵袭能力的影响,Western blotting检测SW480细胞胰蛋白酶、组织因子(tissue factor,TF)和蛋白酶激活受体-2(protease-actieated receptor 2,PAR-2)表达水平。结果:α1-AT(MZ)、α1-AT(ZZ)、TFPI(TC)和TFPI(CC)基因型者大肠癌侵袭与转移的风险均显著增加,且在α1-AT(MZ)和TFPI(TC)之间、α1-AT(MZ)和TFPI(CC)之间、α1-AT(ZZ)和TFPI(TC)及α1-AT(ZZ)和TFPI(CC)之间均存在正向交互作用(均γ>1)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者血清α1-AT(或TFPI)表达明显低于0期组,且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期患者之间血清α1-AT(或TFPI)表达也有明显差异(P<0.01)。同一组携带突变基因型个体的血清α1-AT(或TFPI)表达明显低于携带野生型个体(P<0.01)。体外细胞培养实验显示,α1-AT可明显抑制SW480细胞胰蛋白酶的表达,而TFPI则明显抑制TF表达,而两者均可明显降低细胞PAR-2的表达及细胞迁移和侵袭能力。结论:α1-AT(MZ)、α1-AT(ZZ)、TFPI(TC)和TFPI(CC)基因型均是大肠癌侵袭与转移的高危因素,基因多态性的交互作用增加了大肠癌侵袭与转移的风险。