流式细胞仪分选小鼠Kupffer细胞方法的建立与评价

目的:建立流式细胞仪分选小鼠肝脏Kupffer细胞(KCs)的方法。方法:小鼠肝脏经胶原酶灌注后密度梯度离心法分离非实质细胞,流式细胞分选仪分选单细胞悬液中7-AAD-CD45^(+)CD11b^(+)F4/80^(+)肝脏KCs并检测分选后细胞纯度,台盼蓝染色检测细胞活力,荧光微球吞噬实验检测细胞吞噬功能,CD86、CD206染色鉴定KCs细胞分型,脂多糖(LPS)刺激后检测炎性因子TNF-α、IL-1β的表达情况。结果:经过密度梯度分离和流式细胞分选,获得的7-AAD-CD45^(+)CD11b^(+)F4/80^(+)细胞纯度为(96.1±1.8)%,细胞存活率(96.5±2.1)%,分选后CD86^(+)和CD206^(+)所占比例分别为(92.3±1.6)%、(2.1±0.8)%,吞噬荧光微球的细胞百分比为(84.7±3.6)%,LPS刺激8h后,培养上清液中TNF-α、IL-1β显著升高(P<0.001)。结论:流式细胞分选仪可快速高效分离小鼠肝脏KCs,分选后的KCs保持良好细胞活性和吞噬功能,LPS刺激可诱导其分泌大量炎性因子。

免疫磁性活化细胞分选方法优化及纯化后细胞的生物学特性检测

目的:改良常规免疫磁性活化细胞分选(MACS)的分离纯化方法,提高分选后细胞的纯度并确保细胞仍具有良好活性及功能。方法:以干细胞抗原-1(Sca-1)标记的Sca-1+造血干/祖细胞(Sca-1+HSC/HPC)为例,分别用改良后和常规MACS法分选出小鼠骨髓细胞Sca-1+细胞,流式细胞术检测两种分选方法获得Sca-1+细胞纯度;计算阳性细胞回收率;台酚蓝染色检测分选细胞存活百分率;CCK-8检测细胞增殖,混合造血祖细胞(CFU-Mix)体外培养评价分选Sca-1+细胞分化能力。结果:改良MACS法分选获得的Sca-1+细胞纯度达93%以上(常规MACS法仅为87%),阳性细胞的回收率可达73%(常规法仅为62.3%);细胞存活率、细胞增殖和CFU-Mix集落形成能力两种分选方法无明显差别。结论:改良法能明显提高细胞分选纯度及回收率,细胞活性和功能保持良好,值得各种细胞免疫磁性分选参考采用。

用Midi MACS方法从白血病患者分选CD34^+/CD123^+细胞

本研究的目的是应用MidiMACS方法从急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞分选CD34+/CD123+细胞。首先,用淋巴细胞分离液从AML患者骨髓细胞分离单个核细胞(BMMNC),然后再通过MidiMACS方法相继分选出CD34+细胞,以及从CD34+细胞中分选出CD123+细胞并通过流式细胞术分析分选后细胞的富集度和回收率。结果显示:经过第一次分选后,CD34+细胞的富集度高达98.73%,平均为95.6%,其回收率最高可达到84.6%,平均为51%;第二次分选后,CD34+/CD123+细胞的富集度高达99.23%,平均约为83%;相对于分选前BMMNC而言,CD34+/CD123+细胞的回收率为34%,但相对于第一次分选后的CD34+细胞而言,其回收率为56%。结论:MidiMACS方法可用于AML患者骨髓CD34+/CD123+细胞的分选,分选后细胞的富集度和回收率与文献报道的通过FACS方法所获得的结果相类似。

小鼠肝组织经胶原酶Ⅳ不同时长原位消化后Kupffer细胞的分选效果及其肿瘤细胞吞噬功能观察

目的 观察小鼠肝组织经胶原酶Ⅳ不同时长原位消化后Kupffer细胞的分选效果及其肿瘤细胞吞噬功能。方法 用0.04%胶原酶Ⅳ进行小鼠肝脏原位灌注及肝脏组织消化,根据消化时间长短(5、10、20 min)分为5 min消化组、10 min消化组、20 min消化组。Percoll密度梯度离心后获取肝脏非实质细胞(NPC),通过台盼蓝染色计算细胞活率;免疫细胞磁珠分选(MACS)分选Kupffer细胞后通过台盼蓝染色计数Kupffer细胞总数,除以NPC总数,获得Kupffer细胞MACS分选后占比;光学显微镜观察Kupffer细胞形态学变化;流式细胞术分析Kupffer细胞在MACS分选前占NPC总数的比例,再用Kupffer细胞MACS分选后占比除以分选前占比得到MACS分选得率。体外共培养MACS分选所得Kupffer细胞与肿瘤细胞,流式细胞术检测Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬功能。结果 胶原酶Ⅳ灌注后的肝组织在0.04%胶原酶Ⅳ中于37℃继续消化5 min时NPC总活率、MACS分选的Kupffer细胞数目及Kupffer细胞占NPC的比例、MACS分选得率和细胞形态分析都显示提取效果更佳;且消化5 min时Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬活性显著高于消化10 min和20 min消化组。结论 适当的胶原酶Ⅳ消化时间对Kupffer细胞肝脏原位灌注结合MACS提取是有利的,而且也更有助于Kupffer细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。

乳腺癌干细胞分选方法研究进展

乳腺癌干细胞是来源于正常乳腺干细胞或分化乳腺细胞,具有自我更新能力、分化能力、致瘤性特征及对放疗、化疗、内分泌治疗抵抗的乳腺癌细胞。目前分离乳腺癌干细胞的方法主要有CD44+CD24-/low Lin-、乙醛脱氢酶1(ALDH1)、乳腺球、侧群细胞、DNA标记滞留细胞及改良分选方法等。本文将就近年来乳腺癌干细胞分选方法的研究进展做一综述。

孕妇外周血中胎儿有核红细胞分选富集的方法学研究进展

孕妇外周血中存在胎儿有核红细胞（Fetal nucleated red blood cells，FNRBCs）已不容质疑，但要得到足够数量的FNRBCs并普及使用于无创性产前诊断仍存在一些问题。到目前为止尚未找到FNRBCs特异性的抗原，富集、分选FNRBC8操作复杂，费用昂贵。尽管如此，由于无创性产前诊断对胎儿没有任何风险，不受孕妇年龄和疾病的限制，带给孕妇的痛苦小，因此发展无创性产前诊断技术仍有较好的前景。随着单克隆抗体技术、

实验性创伤后脊髓凋亡细胞的流式细胞仪分选方法

目的：探讨创伤后脊髓凋亡细胞的流式细胞仪分选方法。方法：使用PI和Annexin V/PI检测法进行细胞凋亡的检测和分选。结果：Annexin V/PI检测法细胞凋亡的检出率显著高于PI法（P＜0．05），并可区正常细胞，凋亡细胞和死亡细胞。结论：Annexin V/PI是目前较为理想的细胞凋亡检测和分选方法。

大鼠Kupffer细胞分离方法的优化

目的:对大鼠Kupffer细胞分离方法进行优化。方法:采用D-Hanks液和Ⅳ型胶原酶液两步原位灌注法结合离体消化,差速离心法和Percoll分离液密度梯度离心法分离并选择性贴壁纯化Kupffer细胞。采用328 nm波长自发荧光法、CD68和CD163免疫荧光染色法及吞噬实验鉴定Kupffer细胞。结果:Kupffer细胞获得量为9.8×10~6个/鼠肝,其中活细胞率占93%以上,证实细胞为Kupffer细胞且吞噬功能正常。结论:该方法花费时间短,相对简便、经济,且细胞数量、功能活性和纯度等均达到实验要求。

小鼠肝脏原代Kupffer细胞的分离和纯化

目的利用低速离心和差速贴壁的特性,探索一种高效分离纯化BALB/c小鼠Kupffer细胞(KC)的方法。方法采用0.5 g/L 4型胶原蛋白酶原位灌注和消化肝脏组织,低速分离肝脏的细胞后差速贴壁分离纯化KC,与Percoll密度梯度离心分离方法比较KC的产量和活性,应用F4/80免疫荧光染色鉴定细胞形态、流式细胞术检测F4/80的表达、墨汁吞噬实验进行吞噬功能鉴定。构建KC缺氧/复氧模型,流式细胞术检测主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ、CD40、CD68和CD86的表达,ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。结果每只小鼠肝脏可获得(5.83±0.54)×106个KC,细胞存活率达92%,Percoll密度梯度分离仅能获得(2.19±0.43)×106个KC,F4/80免疫荧光染色显示贴壁后KC呈梭形或棘状,流式细胞术鉴定F4/80阳性细胞占比接近90%,吞墨实验可见胞质内大量被吞噬的碳颗粒。KC在缺氧复氧模型下MHC-Ⅱ、CD40、CD86分子表达增多,并分泌TNF-α参与炎症反应。结论成功建立了BALB/c小鼠KC分离纯化的方法。

双层夹心法培养大鼠Kupffer细胞

目的 建立可长时间维持细胞功能 ,减少细胞破坏的Kupffer细胞培养方法。方法 细胞破坏以乳酸脱氢酶(LDH)含量反映 ,细胞功能以一氧化氮 (NO)和胞内酸性磷酸酶 (ACP)水平反映。以双层夹心法 (doublecollagenculture ,DCC)对比普通培养法 (commonculture,CC)和单层胶原培养法 (singlecollagenculture ,SCC) ,在有或无血清状态下 ,Kupffer细胞功能维持和破坏情况。 结果 双层夹心法在培养 15d内 ,能降低培养上清LDH含量 ,维持NO和胞内ACP水平 ,并可在无血清状态下减少细胞破坏 ,维持细胞功能 ,与另两种方法相比作用显著。结论 双层夹心法对体外研究Kupffer细胞具有实际应用价值。

多参数复合分选表皮干细胞的初步实验研究

目的探索多参数分选,以获得高纯度表皮干细胞(humanepidermalstemcells,hESCs)方法的可行性。方法收集3岁～6岁健康幼儿包皮,以DispaseⅡ和Tropsin分离、收集原代表皮细胞(5例),利用流式细胞仪(FACS)分别进行多种参数分选,即:CD49f+/CD71-表型的细胞分选;直径小于10微米的细胞分选。以及多参数复合分选,即:CD49f+/CD71-且细胞直径小于10微米细胞。对各组分选细胞及未分选细胞进行克隆形成率、细胞最大扩增能力、克隆形成面积的检测比较。计算各种分选方法所对应的细胞回收率。结果单参数分选的两组细胞之间在克隆形成率、细胞最大扩增能力、克隆形成面积三方面无统计学差异(p>0.05)。多参数分选得到的细胞与通过单参数分选的两组细胞均存在统计学差异(p<0.05)。结论利用多参数分选,能获得纯度更高的干细胞表型的表皮细胞。

在新生儿脐带血中分离CD4^+CD25^+T细胞的不同方法的比较

目的寻求获得新生儿脐带血中CD4+CD25+T细胞的优选方案。方法选取了2种细胞阳性分选方法,磁柱分离法和磁铁分离法,进行分别分选。按试剂说明进行操作。获得的分选细胞经显微镜观察,细胞计数仪计数和流式细胞仪检测分析。结果试验中采用磁铁分离法分选,从9.4×107个脐血单个核细胞中分离到3.5×106个的CD4+CD25+T细胞,获得率为3.7%;采用磁柱分离法分选,从7.7×107个脐血单个核细胞中分离到3.9×105个的CD4+CD25+T细胞,获得率为0.5%,纯度约85%。在光学显微镜下,磁铁分离法分选的细胞中有大量类似细胞大小的非折光性微珠存在,

单细胞分离方法及仪器研究进展

如何从复杂异质且数量众多的细胞背景中分离出具有某种特征的纯净细胞实验样本,是长期困扰生命科学和临床病理学研究者的难题。纯净无损高特异性的细胞分离方法对解析生命过程、研究病理机制、确定治疗方案、分析药物疗效具有重要的作用。综述了单细胞分离方法及分离仪器的研究进展,重点梳理荧光激活细胞分选、微流体、激光显微切割、显微操作4种方法。首先,阐述方法的工作原理和部分理论模型。其次,分析几种典型仪器的结构、研究进展及主要性能参数。最后,讨论各种单细胞分离方法的优点和局限性,并展望单细胞分离仪器的发展趋势。

间充质干细胞分离方法的研究与进展

背景:间充质干细胞作为种子细胞广泛应用于组织工程和临床治疗,而安全、高效的分选方法是间充质干细胞建系的前提。目的:综述近年来间充质干细胞分选方法的研究进展,比较各方法的优缺点,为安全、高效分离间充质干细胞提供理论依据。方法:第一作者检索CNKI数据库(http://epub.cnki.net/)和Pub Med数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)的相关文献。中文检索词为"间充质干细胞、分离方法";英文检索词为"mesenchymal stem cells(mscs),isolation methods"。查阅1965至2014年来间充质干细胞分离方法的相关文献,包括综述、临床研究和基础研究,最终纳入52篇文献。结果与结论:1全骨髓贴壁法可快速获得大量间充质干细胞,但需要进一步纯化。2梯度密度离心法选择密度为1.073 g/m L的介质在原代能得到相对较纯的间充质干细胞。3组织消化法适用于脂肪、脐带等组织进行消化分离,选用胶原酶Ⅱ消化效果更佳,但是均存在操作技术要求高的缺陷。4免疫磁珠法适用于研究表达特定细胞表面标记物的某一个间充质干细胞亚群的生物学特性。5各种分离方法相结合也是一种理想选择。6对于近年来出现的分离新方法,由于案例有限,其可靠性有待进一步研究。

本期专题：肿瘤干细胞的分选

1前列腺癌干细胞分离方法的对比及筛选，见2012年16卷6期1011页。2人鼻咽癌CD133^＋干细胞的生物学特性及意义，见2012年16卷6期1007页。3胃癌肿瘤干细胞的分离与成脂分化．见2011年15卷36期6718页。4干细胞相关因子在大肠癌组织及SW620细胞株的表达，见2011年15卷6期1015。

全球首台活体单细胞拉曼分选仪在中国研制成功

中国科学院青岛生物能源与过程研究所基因组团队与北京惟馨雨生物科技公司联合承担的科技部创新方法工作专项“拉曼光钳筛选新方法在活体单细胞高通量分离中的应用”项目正式通过验收。

全球首台活体单细胞拉曼分选仪问世

近日，中科院青岛生物能源与过程研究所功能基因组团队承担的科技部创新方法工作专项“拉曼光钳筛选新方法在活体单细胞高通量分离中的应用”通过验收，标志着全球首台活体单细胞拉曼分选仪在中国研制成功。

蛋白质定向进化的高通量筛选方法

定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略。创建突变库的方法已经有很多而且比较通用,而建立有效的高通量的筛选方法是蛋白质定向进化成功的关键。本文综述了近几年发展起来的用于定向进化的高通量的文库筛选方法,介绍了各种展示技术及流式细胞分选技术的原理及其在文库筛选中的应用,分析了存在的问题及发展趋势。

猪性控精子的筛选方法介绍

细胞染色技术的改进以及采用荧光染料标记活精子的DNA为筛选X或Y精子,进而生产性控后代提供了重要的技术保障.采用流式细胞仪/细胞分选系统筛选精子,虽然其原理依然是X和Y精子DNA含量不同,但对细胞分选系统进行一定程度的改进,以便能够更准确地测定X和Y精子DNA含量的差别.