Kv1.5蛋白在内毒素致血管内皮细胞损伤中的作用机制

目的研究Kv1.5蛋白在内毒素致血管内皮细胞损伤中的作用机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),给予脂多糖(LPS)刺激建立脓毒症模型,并分为:空白对照组、LPS组、LPS+Kv1.5蛋白通道特异性阻滞剂MT1(250nmol/L)组及LPS+MT2(500nmol/L)组,DAPI染色免疫荧光观察各组HUVECs凋亡情况,Western blot检测Caspase-3及Bcl-2蛋白的表达,RT-PCR检测Caspase-3及Bcl-2基因的表达。结果 DAPI染色免疫荧光显示,LPS组内皮细胞核固缩、凋亡小体形成,凋亡小体形成率由空白对照组的(4.2±0.7)%增加至(26.7±0.8)%(P<0.01),而250nmol/L、500nmol/L MT预处理后,凋亡小体形成率从LPS组(26.7±0.8)%分别下降至(12.4±1.0)%、(8.5±0.9)%(均P<0.01);Western blot检测结果显示,LPS组较空白对照组Bcl-2蛋白表达减少、Caspase-3蛋白表达增加(均P<0.01),给予500nmol/L MT预处理后,与LPS组比较,Bcl-2蛋白表达上调、Caspase-3蛋白表达下调(均P<0.01);RT-PCR检测结果显示,LPS组较空白对照组Bcl-2mRNA表达下调、Caspase-3mRNA表达上调(均P<0.01),给予500nmol/L MT预处理后,与LPS组比较,Bcl-2mRNA表达上调、Caspase-3mRNA表达下调(均P<0.01)。结论Kv1.5介导脓毒症相关内皮细胞损伤可能与线粒体凋亡途径有关。

Kv1.5蛋白基于PI3K/Akt信号通路影响内毒素致大鼠血管内皮细胞损伤

目的研究Kv1.5蛋白对内毒素致大鼠血管内皮细胞损伤的机制。方法雄性SD大鼠60只,随机分为Control组、LPS组、DPO-1(Kv1.5特异性通道阻滞剂)低、中、高剂量组,每组12只。Control组尾静脉注射生理盐水,LPS组尾静脉注射LPS 5 mg/kg,DPO-1低、中、高剂量组静脉注射LPS 5 mg/kg前30 min腹腔分别注射不同浓度DPO-1(1、3、5 mg/kg)。于LPS注射后6 h,采集股静脉血样,测定血清硫酸肝素(heparin sulfate,HS)、多配体蛋白聚糖1抗体(syndecan-1,SDC-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)水平。取血样后处死大鼠取胸主动脉内膜组织,实时荧光定量PCR(qPCR)及Western blot检测主动脉内膜组织PI3K、p-Akt mRNA及蛋白表达情况。结果LPS组较Control组SDC-1、HS、TNF-α、IL-6含量明显升高(均P<0.01),DPO-1干预后,SDC-1、HS、TNF-α、IL-6含量降低(均P<0.01);Western blot检测结果显示,与Control组比较,LPS组PI3K、p-Akt蛋白表达水平明显下降(均P<0.01),而DPO-1高、中、低剂量组较LPS组PI3K、p-Akt蛋白表达水平上升(均P<0.01);qPCR检测结果显示,LPS组较Control组PI3K、p-Akt的mRNA表达下调,而DPO-1可抑制这种效应,上调PI3K、p-Akt的mRNA表达。结论Kv1.5特异性通道阻滞剂可能通过激活PI3K/Akt信号通路参与内毒素致大鼠血管内皮细胞损伤。

Kv1.5蛋白对内毒素致血管内皮细胞氧化应激损伤的影响

目的研究Kv1.5蛋白对内毒素(LPS)所致血管内皮细胞氧化应激损伤的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),给予5μg/mL LPS刺激建立脓毒症细胞模型,并分为:空白对照组、LPS组、LPS+MT1组(以Kv1.5特异性通道阻滞剂MT 250nmol/L预处理30min)及LPS+MT2组(MT浓度为500nmol/L)。采用MTT法检测内皮细胞存活率;ELISA法检测细胞上清液中内皮细胞E-选择素(E-selectin)、细胞间粘附分子(ICAM-1)浓度变化;激光共聚焦显微镜观察内皮细胞内ROS水平;比色法检测脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与空白对照组比较,LPS组内皮细胞存活率明显下降[(32.54±1.87)%vs.(98.64±0.92)%,P<0.01],而LPS+MT1组及LPS+MT2组内皮细胞存活率分别为(77.39±1.15)%、(93.22±1.15)%,均较LPS组上升(均P<0.01);LPS组内皮细胞E-selectin、ICAM-1分泌增加(均P<0.01),予以250、500nmol/L MT预处理后,E-selectin、ICAM-1分泌减少(均P<0.01);激光共聚焦显微镜观察内皮细胞内ROS水平发现,LPS组细胞内ROS水平升高为空白对照组的(3.39±0.42)倍(P<0.05),予以250、500nmol/L MT预处理后,ROS水平分别为空白对照组的(1.88±0.36)倍、(1.46±0.47)倍,与LPS组比较,差异有统计学意义(均P<0.05);且LPS组较空白对照组MDA水平上升、SOD活性降低(均P<0.01),而MT预处理可降低MDA含量、增加SOD活性(均P<0.01)。结论 Kv1.5蛋白与内毒素诱导的血管内皮细胞损伤密切相关;MT通过阻断Kv1.5通道可减轻内皮细胞脂质过氧化损伤。

转录辅激活因子p300参与血管紧张素Ⅱ诱导的心房肌细胞I_(kur)离子通道重构的调控

目的探讨转录辅激活因子p300是否参与调控心房肌细胞Kv1.5蛋白的表达。方法以Western Blot检测细胞和C57BL/6小鼠心房组织p300蛋白、钾离子通道蛋白Kv1.5的表达。HL-1细胞在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激的基础上使用p300抑制剂姜黄素或p300 siRNA干预,观察p300对Kv1.5蛋白表达以及超速延迟整流钾电流(I_(kur))的作用。全细胞膜片钳技术检测各组细胞的I_(kur)和动作电位时程(APD)。快速起搏心房观察小鼠心房颤动(房颤)的可诱发性。结果动物实验显示,与对照组相比,AngⅡ处理组小鼠有着明显更高的房颤诱发率(P<0.01),心耳组织p300以及Kv1.5蛋白表达明显升高(均P<0.05),而姜黄素干预后可以明显减少小鼠的房颤诱发率(P<0.01),并使p300和Kv1.5蛋白表达减少(P<0.05)。细胞实验显示,和对照组相比,AngⅡ处理组HL-1细胞p300以及Kv1.5蛋白表达明显升高(P<0.05),I_(kur)电流密度上升,APD缩短。在分别用p300抑制剂姜黄素和p300 siRNA干预后表现为p300和Kv1.5蛋白表达减少(P<0.05),I_(kur)电流密度下降,APD延长。结论AngⅡ可通过p300引起心房肌细胞Kv1.5蛋白表达上升,I_(kur)电流密度上升,引起心房肌细胞电重构。