士的宁对Kv4.3钾通道的影响

目的 探究士的宁对Kv4.3钾通道的影响。方法 于2019年6—10月在大连理工大学以HEK293T细胞为载体,瞬时转染Kv4.3钾通道,形成Kv4.3-HEK293T细胞,一共选取24个Kv4.3-HEK293T细胞,采用全细胞膜片钳技术,加药前记录的数据为对照组,1μmol/L士的宁处理后的数据为观察组,研究士的宁对Kv4.3电流和动力学参数的影响。结果 与对照组相比,1μmol/L士的宁能抑制Kv4.3电流;1μmol/L士的宁能使半数激活电压由(15.41±2.87)mV降到(-2.10±2.08)mV,差异有统计学意义(t=12.101,P<0.001);1μmol/L士的宁能使半数失活电压降低,但差异无统计学意义(P>0.05);1μmol/L士的宁能使失活后恢复时间τ由(38.64±2.10)ms增加到(48.52±2.79)ms,差异有统计学意义(t=6.930,P<0.001)。结论 士的宁作为中枢兴奋药,其作用机制是可以通过影响Kv4.3钾通道的激活和失活后恢复过程来抑制Kv4.3钾电流。

KCNE2对Kv4.3通道功能的调节作用

目的研究KCNE2对人类心肌细胞瞬间外向钾电流的主要α亚基-Kv4.3功能的调节。方法通过基因转染技术将Kv4.3或Kv4.3与KCNE2cDNA转入COS-7细胞株,采用膜片钳全细胞记录方式记录通道电流。结果KCNE2对Kv4.3功能有明显调控作用:减小Kv4.3通道电流密度;Kv4.3单独表达组通道电流密度为375.13±112.87pA/pF(n=11),KCNE2与Kv4.3共表达组电流密度为152.96±33.71pA/pF(n=16);减慢Kv4.3通道激活和衰减,在+60mV电压刺激下通道激活达峰值的时间由4.82±0.32ms(n=11)延长至20.41±2.13ms(n=16),P<0.05;通道电压依赖性失活发生正向移位,半数失活电压由-53.62±1.24mV(n=8)移至-46.58±1.6mV(n=10);通道从失活中恢复的速度加快,恢复时间常数由193.43±17.98ms缩短137.71±18.29ms,(n=7,P<0.05)。结论KCNE2可能作为人类心肌细胞膜Kv4.3钾离子通道一个重要的辅助亚基-β亚基参与Ito通道功能的调节。

睡眠剥夺致大鼠心律失常的KV4.3钾离子通道机制研究

目的观察睡眠剥夺后大鼠的心电图改变及其心室肌组织KV4.3钾离子通道mRNA和蛋白表达情况,探讨睡眠剥夺致心律失常的发生机制。方法 48只清洁级健康成年雄性SD大鼠随机分6组(每组8只):正常对照(CC)组,大平台实验(TC)组及睡眠剥夺(SD)13、5、7、d组。睡眠剥夺(SD)组以改良多平台睡眠剥夺法(MMPM)建立睡眠剥夺模型,观察13、5、、7d睡眠剥夺后大鼠心电图的变化,并通过RT-PCR及Western blotting方法检测大鼠心肌组织KV4.3钾离子通道基因的mRNA和蛋白表达水平。结果睡眠剥夺后大鼠心电图改变以心律失常为主:与CC组大鼠比较,TC组大鼠心电图表现为窦性心动过速;SD1d组出现频发房性早搏;SD3d组出现室性心律失常(表现为频发的多形性室性早搏及短阵室速);SD5d组呈不完全性右束支传导阻滞波形;SD7d组房性心律与室性心律分离,呈三度房室传导阻滞波形,伴室性逸搏、窦性停搏,ST段明显抬高并与高尖的T波融合。随着睡眠剥夺时间的延长,心肌组织KV4.3钾离子通道mRNA及蛋白表达水平均呈逐渐下调趋势,至睡眠剥夺7d时,mRNA及蛋白表达量分别仅为正常大鼠的1/9和1/4。结论睡眠剥夺可致大鼠心律失常,并随剥夺时间的延长而加重;心肌组织KV4.3钾离子通道基因表达下调可能是睡眠剥夺致心律失常的机制之一。

普罗帕酮对钾通道亚型Kv4.2和Kv4.3电流的影响

目的 研究普罗帕酮对钾通道亚型Kv4 2和Kv4 3电流的影响。方法 采用全细胞膜片钳技术记录稳定表达Kv4 2和Kv4 3电流的人胚胎肾细胞株 (HEK2 93细胞 )电流的变化。结果 ①普罗帕酮明显抑制Kv4 2和Kv4 3电流 ,呈浓度依赖性 ,IC50 分别为 1 0 3 μmol·L- 1 和 71 μmol·L- 1 ;②普罗帕酮明显加速Kv4 2和Kv4 3电流失活 ,1 0μmol·L- 1 的普罗帕酮可使Kv4 2电流衰减时间常数τ由(38 9± 2 1 )ms变为 (9 9± 1 8)ms ,半数最大失活膜电位V1 /2 由 (- 66 6± 0 8)mV左移至 (- 70 9± 1 1 )mV ;1 0 0μmol·L- 1 的普罗帕酮可使Kv4 3电流衰减时间常数τ(1 4 4 8± 2 0 8)ms变为 (1 8 5± 2 8)ms,半数最大失活膜电位V1 /2 由 (- 4 5 6± 1 9)mV左移至 (- 52 3± 2 1 )mV ;③普罗帕酮明显左移Kv4 2和Kv4 3电流的激活曲线 ,1 0μmol·L- 1 的普罗帕酮可使Kv4 2电流半数最大激活膜电位V1 /2 由 (- 4 1± 0 5)mV左移至 (- 1 6 1± 2 4)mV ;1 0 0μmol·L- 1 的普罗帕酮可使Kv4 3半数最大激活膜电位V1 /2由 (- 6 0± 1 1 )mV左移至 (- 1 6 5± 3 0 )mV。结论 普罗帕酮明显抑制Kv4 2 ,Kv4 3电流 ,该作用可能是其治疗心律失常的机制之一。

Kv4.3通道蛋白在心力衰竭调节中的分子机制

Kv4.3通道蛋白作为瞬时外向钾电流的核心功能结构,在心肌细胞早期复极化中发挥重要作用。Kv4.3通道蛋白下调致使动作电位时程延长,钙离子内流增加,从而影响心肌细胞钙调节和兴奋收缩耦联;增加的胞内钙离子激活钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)和钙调神经磷酸酶,导致心肌肥厚和心力衰竭的发生。此外,Kv4.3通道蛋白下调促使CaMKⅡ从Kv4.3-Ca MKⅡ复合物中分离并激活,加速心力衰竭过程。上调Kv4.3通道蛋白可抑制CaMKⅡ过度活化及其严重后果,可能是治疗心力衰竭的一大靶点。

KCNE2的两种突变体I57T和V65M对Kv4.3通道功能的调节

Mink相关蛋白1(MiRP1)是由KCNE基因家族成员KCNE2编码的具有一个跨膜结构的小分子蛋白质,发生在KCNE2上的相关突变能够引起遗传性长QT间期综合症(long QT syndrome,LQT6),但其机制不明.以往的工作表明,MiRP1调节瞬间外向钾电流(transient outward current,Ito)的功能,对维持心电稳定性具有重要的调节作用.在哺乳细胞系COS-7表达系统利用膜片钳全细胞记录方式,研究了两种LQT6相关的突变体I57T和V65M对Kv4.3通道功能的影响,从MiRP1对Ito功能调控的改变探讨LQT6引起心律失常的电生理机制.结果表明,KCNE2与Kv4.3共表达后对通道功能具有明显的调控作用,使通道的激活和失活明显减慢,电压依赖性失活发生正向移位,同时加快Kv4.3通道从失活中的恢复.I57T与Kv4.3共表达的通道,门控动力学以及通道的恢复特性更接近Kv4.3单独表达的通道,表现为丧失KCNE2的功能——"loss of function",而V65M的作用则与之刚好相反,对Kv4.3门控动力学和恢复特性的调节较KCNE2更强,同时,使通道电流密度明显降低,表现为增强KCNE2的功能——"gain of function".由此推论,KCNE2对Ito功能有重要的调节作用,发生在KCNE2基因上的突变,无论是增强(V65M)还是减弱(I57T)KCNE2的功能都可能通过改变Ito在心脏电稳定性中的贡献,从而使心脏在某些条件下发生心律失常.

电压门控快钾通道蛋白Kv4.3的抗体制备及检测

Kv4(voltagegatedK+channel4)是在哺乳动物心脏和脑组织中广泛表达的一类钾离子通道蛋白.它主要介导心肌细胞和神经细胞中的A-型(快速失活型)K+电流,是构成中枢神经系统和心肌细胞中的快速失活外向型电流的基础.Kv4.3是电压门控钾离子通道3种α亚基之一.通道中含有许多具有调节作用的辅助亚基,它们通过与Kv4.3互作实现对通道的调节.本研究根据人类氨基酸序列以MAPs法制备抗Kv4.3抗体.MAP由4条相同的17肽段连接成锥形结构分子.以MAP或MAP与佐剂免疫新西兰白兔,抽提了免疫前血清和免疫后血清,并对抗体的滴度进行评价.MAPs在白兔体内诱导出了效价比为1:1000的抗Kv4.3特异性抗体.

细胞外钾离子对KV4.3通道失活动力学的影响

观察细胞外钾离子对KV4.3通道失活动力学的影响。用电压钳技术研究非洲爪蟾卵母细胞中表达的KV4.3通道在细胞外正常浓度(2mmol/L)钾离子([K+]O)和高浓度(98mmol/L)时的通道电流。结果:与2mmol/L[K+]O的作用相比较,98mmol/L[K+]O加速了KV4.3通道的开放状态失活,并有加快关闭状态失活的趋势,同时减慢失活后恢复,但对KV4.3稳态失活无明显作用。结论:在正常生理条件下,KV4.3通道失活主要由开放状态失活所主导。

Akt-Kv4.3-CaMKⅡ在有氧运动抑制压力负荷小鼠心肌肥厚中的作用及其机制

目的探讨丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)-离子通道Kv4.3(Kv4.3)-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)信号通路在有氧运动抑制压力负荷小鼠心肌肥厚中的作用及其机制。方法 60只实验小鼠均分为5组:假手术(SHAM)组、主动脉缩窄手术(TAC)组、假手术+有氧运动(SHAM+E)组、主动脉缩窄术+有氧运动(TAC+E)组,主动脉缩窄术+有氧运动+Akt抑制剂Perifosine(TAC+E+Peri)组。高分辨率小动物超声系统评价小鼠心功能及肥厚程度,麦胚凝集素(WGA)染色检测心肌细胞横截面积;荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ANP表达,Western blot检测蛋白心房钠尿肽(ANP)、p-Akt、Kv4.3、p-CaMKⅡ表达水平。结果与SHAM组相比,TAC促进心肌肥厚,恶化心功能(P<0.01)。给予有氧运动训练后,TAC+E组较TAC组小鼠心功能改善,心肌肥厚程度减轻(P<0.01)。同时Western blot检测显示,TAC组较SHAM组p-Akt、Kv4.3表达降低,p-CaMKⅡ上调(P<0.01);TAC+E组p-Akt和Kv4.3表达较TAC小鼠增加,p-CaMKⅡ下调(P<0.01)。而给予Akt抑制剂Perifosine后,相比于TAC+E组,TAC+E+Peri组心功能恶化、心肌肥厚程度和ANP表达增加,心肌细胞横截面积增大,同时伴随Kv4.3表达降低、p-CaMKⅡ增高(P<0.01)。结论有氧运动训练能够通过调节Akt-Kv4.3-CaMKⅡ信号通路抑制压力负荷心肌肥厚。

Ito主要功能单位Kv4.3与心脏疾病发生的关系研究进展

Kv4.3是瞬时外向整流钾离子通道Ito的功能α亚基,多种调节蛋白和细胞内第二信使参与Kv4.3的调节,进而调节Ito表达。Kv4.3表达密度的改变与其编码基因KCND3异常可引起通道结构缺陷、功能异常,与多种心脏疾病密切相关。Brugada综合征、早期复极综合征、长QT间期综合征、房颤、心肌梗死、心力衰竭等多种心脏疾病的发生发展与编码Kv4.3的基因异常、Kv4.3表达异常有关,调控Kv4.3表达或可治疗某些心脏疾病,改善患者预后。研究生理及病理状态下的Kv4.3有助于探究相关疾病的治疗方法,寻找新靶点,完善个体化治疗。

敬钊毒素-V对Kv4.3通道的抑制作用

K+通道亚型Kv4.3在调节心肌细胞动作电位的幅度与时程方面具有重要作用,是治疗心律失常的有效作用靶点,但目前世界上该通道的特异性抑制剂非常缺乏。敬钊毒素-V(Jingzhaotoxin-V,JZTX-V)是从敬钊缨毛蜘蛛粗毒中纯化到的一种新型肽类神经毒素,能够部分抑制大鼠背根神经节细胞上的瞬时外向K+电流,其半数有效抑制浓度(IC50值)为52.3nmol/L。为了研究JZTX-V对Kv4.3通道的作用,本实验通过多肽固相化学合成的方法得到JZTX-V,并用双电极杆电压钳技术检测JZTX-V对表达在非洲爪蟾卵母细胞上的Kv4.3通道电流的作用。结果显示,JZTX-V能够完全抑制Kv4.3通道电流,并且这种抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性,其IC50值为425.1nmol/L,JZTX-V还能够使通道的电流-电压关系曲线和稳态失活曲线分别向去极化方向漂移大约29mV和10mV,改变Kv4.3通道的动力学特征,因此我们推测JZTX-V是一种Kv4.3通道门控调制毒素。以上研究结果对于开发心肌Kv4.3通道的分子探针及以Kv4.3通道为靶点的药物设计具有借鉴作用。

兔心房组织Kv4.3钾通道基因表达的增龄性变化研究

目的观察不同年龄组兔心房Kv4.3钾通道mRNA表达的增龄性变化。方法选择家兔24只,分为幼年组(14~21d)、成年组(8~10个月)、老年组(30~35个月),每组8只,实时荧光定量PCR检测兔心房Kv4.3钾通道mRNA表达情况。结果 3组Kv4.3钾通道mRNA表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。老年组与幼年组比较表达水平明显增高(P<0.05);成年组与老年组表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论增龄引起Kv4.3钾通道转录水平的增高,可能是参与心房颤动电重构的一个。

瞬时外向钾通道Kv4.3真核表达载体的构建

[目的]构建Kv4.3真核表达载体,观察其在真核细胞中表达情况。[方法]提取小鼠前额叶皮质RNA,通过RT一PCR和常规PCR技术扩增获得Kv4.3目的基因,利用EcoRI和XbaI限制性内切酶和T4DNA连接酶将其克隆在peDNA3.1载体中,并将构建好的重组质粒转染至HEK293细胞中,免疫印迹方法检测Kv4.3蛋白表达。[结果]成功扩增了Kv4.3基因(2000bp处有明显条带),先后经酶切和酶连后的重组体转化培养,提取质粒,再通过双酶切观察到2000bp处有Kv4.3目的条带和5400bp处有peDNA3.1载体条带。将此重组质粒送去测序,结果显示基因测序结果与GenBank中Kv4.3序列-致。免疫印迹结果发现在HEK293细胞中,转染的重组质粒能够表达Kv4.3蛋白。[结论]成功构建了Kv4.3真核表达载体,其在HEK293细胞中可以稳定表达。

体内心肌缺血微环境下大鼠骨髓间充质干细胞钾离子通道的表达

目的动态观察在体内心肌缺血微环境下,大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向心肌细胞分化过程中主要钾离子通道的分化表达。方法采用左冠状动脉前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)结扎术建立大鼠急性心肌梗死(myocardial infarction,MI)模型(n=60),将绿色荧光蛋白(green fluorescent pro-tein,GFP)标记的MSCs,心外膜下注射移植到心肌梗死周边区;免疫荧光染色观察移植后3d(MI-3d组)、5d(MI-5d组)、7d(MI-7d组)、9d(MI-9d组)MSCs的存活情况及其主要钾离子通道(Kv1.4、Kir2.1、Kv4.3、Kca1.1)蛋白的表达;应用激光捕获显微切割技术分离以上各组心肌组织中GFP标记的MSCs群,应用Real-time PCR测定其Kv1.4、Kir2.1、Kv4.3、Kca1.1的mRNA表达。结果免疫荧光染色观察到移植的MSCs于移植后第3天开始持续表达Kv1.4、Kir2.1、Kv4.3,不表达Kca1.1,于移植后第9天几乎未观察到MSCs;Real-time PCR结果显示移植后3、5、7d,移植的MSCs上Kv1.4和Kir2.1表达呈逐步增多趋势,差异具有统计学意义(P<0.05),Kv4.3的表达无此变化趋势,但高于未移植MSCs,未见明显差异。结论移植的MSCs在大鼠体内心肌缺血微环境下向心肌细胞分化的过程中能够表达部分钾离子通道表型,但其不能长时间、有效的存活。

LOC389023在难治性颞叶癫痫中分子海绵机制的预测

【目的】研究可能与LOC389023和二肽基肽酶10(DPP10)作用的micro RNA在难治性颞叶癫痫患者皮质中的表达变化,预测LOC389023在颞叶癫痫中的分子海绵机制。【方法】15例脑外伤患者切除的皮质为正常组,26例难治性颞叶癫痫患者行癫痫灶切除的皮质为癫痫组。运用western blot、免疫组织化学染色检测DPP10和电压依赖性钾通道4.3(Kv4.3)的表达变化,采用免疫荧光染色对DPP10和kv4.3进行定位,采用免疫共沉淀分析DPP10与Kv4.3的相关性。运用miRanda、Pita、Target Scan和miRDB软件分别预测与LOC389023以及DPP10相互作用的micro RNA。采用q PCR技术检测LOC389023以及micro RNA的表达变化。【结果】免疫组织化学染色和western blot分析结果显示,DPP10在癫痫组中高表达(P<0.05),Kv4.3则低表达(P<0.05);DPP10与Kv4.3共表达于神经元的细胞膜且两者有相互作用;通过软件预测得到5个候选micro RNA(miR-32-5p,miR-140-5p,miR-367-3p,miR-25-3p和miR-4325);q PCR检测结果显示:在癫痫组中,LOC389023和miR-140-5p表达水平均低于对照组(P<0.05),miR-25-3p和miR-367-3p表达水平均高于对照组(P<0.05),而miR-32-5p和miR-4325无明显变化(P>0.05)。【结论】LOC389023可能以分子海绵的机制调控miR-25-3p和miR-367-3p,继而调控DPP10的表达参与癫痫的形成。

心房颤动患者瞬间外向钾电流重构的分子基础

目的 研究心房颤动 (AF)患者瞬间外向钾电流 (Ito1)重构的分子基础。方法 应用RT PCR、免疫组化和免疫电镜方法检测持续窦性心律 (SR)、阵发性AF (PAF)、慢性AF小于或等于 6个月 (AF≤ 6M )和大于 6个月 (AF >6M )组患者右心耳组织电压依赖kv4 3钾通道α亚基(VDkv4 3α)基因和蛋白表达 ,并以图像分析系统对组化抗原表达进行半定量分析。结果 PAF、AF≤ 6M和 >6M组kv4 3αmRNA的表达明显低于SR组。kv4 3αmRNA表达与AF分数、左心房内径及平均心房率成明显负相关 ,经ANOVA剔除左心房内径的影响 ,各组mRNA表达较SR组仍显著下降 (P <0 0 5 )。离子通道阳性表达为棕褐色的细颗粒状 ,主要分布在细胞膜和胞浆内的T管系统 ;免疫电镜检测 ,VDkv4 3α特异的阳性表达为电子密度高的黑色圆形胶体金颗粒 ,在细胞膜呈现不连续的点状分布 ,在胞浆T管内呈点状散在分布。组化结果半定量分析表明 ,PAF、AF≤ 6M和AF >6M组中kv4 3α蛋白表达较SR组均明显下降 ,kv4 3α蛋白的表达与临床资料进行直线回归分析 ,发现kv4 3α的蛋白表达仅与AF分数呈明显负相关 ;并且 5例风湿性心脏病患者左、右心耳VDkv4 3α蛋白表达差别不明显。结论 VDkv4 3钾通道除分布在细胞膜外 ,广泛分布在胞浆的T管系统。