屈膝点按叩揉法调控L型电压依赖性钙通道影响软骨细胞代谢的机制研究

[目的]通过分析屈膝点按叩揉法调控L型电压依赖性钙通道影响软骨细胞合成代谢,探讨该手法防治膝骨性关节炎(KOA)的分子机制。[方法]50只新西兰大耳白兔随机分成5组,运用Hulth造模法构建KOA兔模型,治疗组采用屈膝点按叩揉法治疗,阳性对照组采用关节腔注射玻璃酸钠注射液治疗,正常组、假手术组及模型组同条件饲养。通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测L型电压依赖性钙通道α1亚基及合成代谢相关蛋白的表达。[结果]治疗组、阳性对照组Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4、PTHr P、ColⅡ蛋白的表达均高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05),治疗组Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4、PTHr P、ColⅡ蛋白的表达与阳性对照组相比无统计学差异(P>0.05)。[结论]屈膝点按叩揉法通过影响L型电压依赖性钙通道蛋白,增加细胞内钙离子浓度,上调甲状旁腺激素相关蛋白(PTHr P)的表达,进而发挥促软骨细胞合成代谢的作用。

L型钙通道α_(1c)蛋白在犬肺静脉前庭中表达的研究

目的研究快速起搏心房引起心房颤动(简称房颤)动物模型肺静脉前庭中L型电压依赖性钙通道(L-type voltage dependent calcium channel,LVDCC)α1c蛋白表达。方法通过建立犬房颤模型,并按是否产生房颤设立房颤组、窦性心律组和对照组,应用免疫组织化学方法检测各组肺静脉前庭中LVDCCα1c蛋白表达,用图像分析系统对组织化学抗原表达进行半定量分析。结果α1c蛋白阳性表达在发生房颤的犬肺静脉前庭组织中表达明显下降,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。而同样条件下,不能诱发房颤的犬肺静脉前庭组织中α1c蛋白表达与对照组相比差别无显著性(P>0.05)。结论肺静脉前庭组织中LVDCC蛋白表达的变化可能参与了心房的电重构和心房颤动的发生和维持,该通道的变化也可能是房颤难以自发终止的原因之一,也可能是房颤发生的机制之一。

Obestatin抑制胰岛β细胞株INS-1细胞L型钙通道电流

目的观察obestatin对胰岛β细胞株INS-1细胞L型钙通道电流的影响。方法应用穿孔全细胞膜片钳技术研究obestatin对培养的胰岛β细胞株INS-1细胞膜L型电压敏感钙通道电流(L-type calcium ion channel current,ICa,L)的影响。结果胰岛β细胞株INS-1细胞钳制膜电位为-20 mV时,分别给予胰岛β细胞株INS-1细胞0nM(对照组)和1、10、100nM obestatin灌流5min后,ICa,L峰值呈浓度依赖性降低,各组为给药前的(97±8)%、(91±7)%、(60±9)%和(45±6)%。其中,10nM和100nM obestatin灌流5 min后ICa,L峰值与对照组相比显著减小(P<0.01,n=5)。胰岛β细胞株INS-1细胞钳制膜电位分别为-30、-20、-10和0mV时,给予10nM obestatin之前,其ICa,L峰值分别为(-5.48±0.69)、(-5.70±0.68)、(-5.58±0.61)和(-3.90±0.44)pA/pF,灌流10nM obestatin 5 min后,ICa,L峰值分别下降至(-3.11±0.68)、(-3.60±0.99)、(-3.26±1.03)和(-2.28±0.71)pA/pF,均明显低于obestatin给药前(P<0.01,n=5)。结论 obestatin可抑制胰岛β细胞株INS-1细胞L型钙通道电流。

高血压促进血管平滑肌细胞L型钙离子通道重塑的研究进展

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表达多种离子通道,包括各型钙离子通道,其中L型电压依赖型钙离子通道(L-type voltage-dependent calcium channels,LTCC)对于调节微小动脉血管张力发挥着重要作用。高血压时动脉血管张力异常增高,这种血管张力的变化又会影响LTCC的功能和表达。本篇综述将重点阐述VSMCs上研究较为充分的LTCC。首先,简要介绍LTCC在血管功能调节方面的作用;其次,讨论高血压时VSMCs上LTCC功能和表达变化的最新研究;最后,根据现有研究阐述LTCC作为高血压治疗靶点的应用前景。

钙/钙调蛋白通过铁过载介导心肌梗死中心肌细胞铁死亡

心肌梗死(myocardial infarction,MI)作为一种严重危害人类健康的急性冠脉综合征,包括钙超载等多种病理生理过程参与其中。现有的治疗方法及预防措施存在局限性,不能对再生潜力较差的心肌细胞进行有效修复。探究心肌细胞多种程序性死亡方式都是心肌梗死治疗潜在重要靶点,而铁死亡(ferroptosis)作为一种新型细胞死亡方式在心肌梗死中的潜在作用引起人们的极大关注。本研究旨在探讨钙及钙调蛋白(calmodulin,CaM)是否参与心肌梗死中心肌细胞铁死亡,并对其作用机制进行深入研究。我们使用CCK-8和碘化丙啶(propidium Iodide,PI)染色检测细胞活性;通过分光光度法测量心肌丙二醛(malondialdehyde,MDA)及还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量;通过Western印迹检测蛋白质的表达,结果显示,大鼠心肌细胞(H9c2)在遭受缺氧(hypoxia)损伤时,细胞的活性、GSH含量以及SLC7A11和GPX4的表达均显著降低,细胞的死亡率、MDA含量显著增加,但给予铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)和铁螯合剂Deferoxamine(DFO)处理后发现,缺氧损伤被明显抑制;同时,缺氧导致H9c2细胞内Ca^(2+)浓度增加、钙调蛋白及其Ca^(2+)/钙调蛋白依赖性激酶(CaMK)家族包括CaMKII和CaMKIV表达水平增加;使用CaM拮抗剂Calmidazolium chloride(CCL)或CaM-siRNA均能明显抑制缺氧诱导的心肌细胞铁死亡。此外,L型电压型依赖钙通道(L-type voltage-dependent calcium channel,LVDCC)阻滞剂维拉帕米(verapamil)的加入可以明显抑制缺氧导致的H9c2细胞中铁过载。最后,心肌梗死动物模型证明,心肌梗死损伤中CaM蛋白表达上调,CaM拮抗剂CCL在铁死亡介导的心肌梗死损伤中发挥作用。本研究揭示了Ca^(2+)/CaM通过调控LVDCC可能作为抑制铁死亡的新靶点,对铁死亡及其抑制剂机制的深入探索,有望将铁死亡确定为心肌梗死损伤的新型诊断和治疗靶点。

有氧运动通过AMPKα调控高血压肠系膜动脉平滑肌CaL通道功能

腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)被称为细胞能量代谢调节器,其α亚基主要起催化作用,同时也是大鼠血管壁细胞的主要激酶形式。除能量代谢外,AMPKα还可参与调控高血压的发生和发展,但其具体的作用机制尚不完全清楚。本研究拟以自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)肠系膜动脉为研究对象,探究AMPKα对肠系膜动脉舒张功能的影响,并阐述其作用机制。选取12周龄雄性正常血压大鼠(Wistar-Kyoto,WKY)和SHR,将其随机分为安静对照组(WKY-SED,SHR-SED)和有氧运动组(WKY-EX,SHR-EX)。有氧运动组进行为期12周的中等强度跑台运动。测定各组大鼠实验前后体重、血压,随后通过微血管张力技术、膜片钳技术、Western印迹分别测定AMPKα对血管张力的影响,AMPKα与L型电压依赖性钙离子通道(voltage-dependent L-type Ca2+channel,CaL)的关系,以及p-AMPKα和AMPKα的表达水平。结果显示,有氧运动后,高血压大鼠体重、血压均显著降低(P<0.05);微血管张力技术测定结果表明,AMPKα特异性激动剂PT1可诱使各组血管舒张。其中,SHR-SED组舒张程度显著高于WKY-SED(P<0.05)。与SHR-SED组相比,SHR-EX组血管舒张程度显著降低(P<0.05),与WKY-SED组相比,WKY-EX组舒张程度显著增加(P<0.05)。进一步对AMPKα的作用机制进行探究发现:PT1可抑制CaL通道电流,其中,SHR-SED组CaL通道电流降低幅度显著高于WKY-SED组(P<0.05),12周有氧运动后,SHR-EX组电流幅值降低幅度显著减小(P<0.05),WKY-SED组与WKY-EX间无显著性差异(P>0.05);Western印迹结果显示,SHR-SED组p-AMPKα表达显著减少(P<0.05)。12周干预后,WKY-EX、SHR-EX组p-AMPKα表达均显著增加(P<0.05),但各组间AMPKα表达无显著差异(P>0.05)。其总的结果表明,有氧运动通过激活AMPKα抑制高血压肠系膜动脉平滑肌细胞CaL通道功能,从而改善高血压阻力动脉的舒张功能,降低血压。

急性缺氧对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度的影响

目的：研究急性缺氧对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞（PVSMC）细胞内钙浓度（[Ca^2＋]i）的影响及L型电压依赖性钙通道（VDCC）阻断剂硝苯地平的作用，为缺氧性肺动脉高压发病机制的进一步研究提供理论依据。方法：胶原酶消化法培养大鼠远端PVSMC，利用荧光显微镜和细胞内钙浓度检测系统观测急性缺氧（4％O2）、高钾（60mmol／LKCl）溶液对PVSMC的[Ca^2＋]i影响及硝苯地平的干预作用。结果：对照组PVSMC的[Ca^2＋]i随时间变化维持基线水平；缺氧组PVSMC急性缺氧后，[Ca^2＋]i迅速升高并维持平台水平，△[Ca^2＋]i达82．83nmol／L＋23．03nmol／L；硝苯地平干预组PVSMC予急性缺氧和5μmol／L硝苯地平干预后，[Ca^2＋]i升高幅度较小；高钾溶液孵育PVSMC后，[Ca^2＋]i迅速增高，5μmol／L硝苯地平能完全阻断PVSMC的[Ca^2＋]i对高钾溶液的反应。结论：急性缺氧可使大鼠远端PVSMC的[Ca^2＋]i升高，其机制可能与激活PVSMC的VDCC和另外的非VDCC依赖的钙通道导致细胞外Ca^2＋内流有关。

蓝光对人视网膜色素上皮细胞内钙离子浓度的影响及机制研究

目的:观察蓝光对人视网膜色素上皮细胞内钙离子浓度的影响并初步探讨其可能机制。方法:利用35 W白色冷光灯加用蓝色滤光片建立蓝光损伤体外培养的RPE细胞模型,蓝光控制波长范围在470~520nm,光照强度在2000lux左右,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测RPE细胞内游离钙离子浓度,利用Western blot技术和膜片钳技术分别检测RPE细胞Cav1.2蛋白的表达和L型电压依赖性钙离子通道的功能。结果:与对照组相比,照射组的RPE细胞内游离钙离子浓度增加;照射后RPE细胞Cav1.2蛋白表达增加,且L型电压依赖性钙离子通道功能增强。结论:蓝光可通过增加RPE细胞Cav1.2蛋白表达和L型电压依赖性钙离子通道的功能促进细胞内游离钙离子浓度的增加,从而引起RPE细胞的损伤,L型电压依赖性钙离子通道有望成为治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病的新靶点。

白果内酯对糖氧剥夺小鼠原代海马神经元内钙离子浓度的影响

目的:观察白果内酯对糖氧剥夺(OGD)后小鼠原代海马神经元内游离钙离子浓度的影响及机制探究。方法:分离和培养小鼠原代海马神经元,实验分为对照组(control)、糖氧剥夺组(OGD)和白果内酯组(OGD+bilobalide),对照组予以常规培养小鼠原代海马神经元,糖氧剥夺组利用氧葡萄糖剥夺/再恢复模型模拟小鼠原代海马神经元的缺血再灌注损伤,白果内酯组在氧葡萄糖剥夺后再恢复前应用20μmol/L的白果内酯。利用流式细胞仪检测各组小鼠原代海马神经元内游离的钙离子浓度,利用Western Blot技术检测各组小鼠原代海马神经元Cav1.2蛋白的表达,最后利用膜片钳技术检测各组小鼠原代海马神经元L型电压依赖型钙离子通道的功能。结果:与糖氧剥夺组相比,白果内酯组小鼠原代海马神经元游离钙离子浓度降低(P<0.05)、Cav1.2蛋白表达量减少(P<0.05)、L型电压依赖性钙离子通道功能减弱(P<0.05),但仍未恢复到对照组水平(P<0.05)。结论:白果内酯可能通过减少小鼠原代海马神经元Cav1.2表达和L型电压依赖性钙离子通道的功能降低细胞内游离钙离子浓度,从而发挥对糖氧剥夺后神经元的保护作用。

人参皂甙Rh2对人胶质瘤细胞内钙离子浓度的影响

目的观察人参皂甙Rh2对人胶质瘤细胞内钙离子浓度的影响。方法实验分为对照组和人参皂甙Rh2组,对照组应用常规培养基培养人胶质瘤细胞株U87MG,人参皂甙Rh2组在常规培养基中人参皂甙Rh2的浓度为20μg/m L,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测各组培养的人胶质瘤细胞内钙离子浓度,再利用Western blot技术检测人胶质瘤细胞Cav1.2蛋白的表达,最后利用膜片钳技术检测人胶质瘤细胞L型电压依赖型钙离子通道的功能。结果人参皂甙Rh2处理U87MG细胞后,细胞内钙离子浓度是对照组的2.5倍(P<0. 05);人参皂甙Rh2培养后胶质瘤细胞Cav1.2蛋白表达量是对照组的1.5倍(P<0. 05),且L型电压依赖性钙离子通道功能增强。结论人参皂甙Rh2可通过增加胶质瘤细胞Cav1.2表达和L型电压依赖性钙离子通道的功能促进细胞内游离钙离子浓度的增加,从而诱导人胶质瘤细胞的凋亡。

维生素D与儿童和青少年2型糖尿病发病分子机制研究进展

2型糖尿病(T2DM)在全球的发病率不断上升。随着儿童肥胖率的增加,T2DM的发病率在儿童当中也呈现出上升的趋势。与成年患者相比,儿童T2DM患者血糖控制持久性更差,且更容易出现并发症。近年来,研究发现成人患者中维生素D缺乏与T2DM发病密切相关,在儿童与青少年群体中的研究报道也越来越多。机制方面,维生素D具有提高胰岛素敏感性和调节胰岛素分泌的作用,维生素D调节胰岛的敏感性可能与肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAAS)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)及氧化应激系统等通路有关,也可通过调节蛋白激酶A(PKA)、L型电压依赖性钙通道(L-type VDCC)、磷脂酶C(PLC)、ATP敏感性钾通道(K ATP)等信号分子刺激胰岛素的分泌。本文旨在阐述维生素D缺乏与儿童和青少年T2DM发病关系及相关分子机制,为儿童和青少年T2DM的预防和治疗提供参考。