2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的酶法合成及其应用研究进展

2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(2-O-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G)不仅稳定性强且保留了L-抗坏血酸(L-ascorbic acid,L-AA)的大部分生理活性,是L-AA最好的替代品。体外酶法合成AA-2G具有经济、快速、绿色和安全等显著优势,是规模化生产AA-2G的可行方法。该文综述体外酶法合成AA-2G的研究进展,重点梳理环糊精糖基转移酶和蔗糖磷酸化酶合成AA-2G的研究现状,并对AA-2G的功能及应用前景进行讨论和展望。

血清维生素D、IL-6及IL-8水平与早产儿支气管肺发育不良的相关性

目的 分析血清维生素D、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)水平与早产儿支气管肺发育不良(BPD)的相关性。方法 选择2020年1月至2023年1月于唐山市妇幼保健院三级新生儿重症监护病房出生的早产儿(胎龄≤35周,住院时长≥28 d)216例,依据BPD诊断标准分为BPD组(n=120)、非BPD组(n=96)。比较两组第1、7、14、21、28 d血清1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2D3]、IL-6、IL-8水平变化。比较BPD组出院时不同病情程度血清1,25-(OH)2D3、IL-6、IL-8水平变化。分析血清1,25-(OH)2D3、IL-6、IL-8水平与FiO2水平变化的相关性。结果 随着时间推移,两组血清1,25-(OH)2D3水平均在第21 d降到最低值,且BPD组在各时间点血清1,25-(OH)2D3水平均低于非BPD组,差异具有统计学意义(P<0.05)。随着时间推移,两组血清IL-6、IL-8水平分别在第14、21 d达到顶峰,且BPD组各时间血清IL-6、IL-8水平均高于非BPD组,差异具有统计学意义(P<0.05)。1,25-(OH)2D3水平:重度<中度<轻度,IL-6、IL-8水平:重度>中度>轻度,差异具有统计学意义(P<0.05)。以血清1,25-(OH)2D3、IL-6、IL-8为因变量,经Pearson’s Correlation皮尔逊相关性结果得知,血清1,25-(OH)2D3与FiO2水平呈负相关,血清IL-6、IL-8水平与FiO2水平呈正相关(P<0.05)。结论 血清维生素D、IL-6及IL-8水平与早产儿BPD发生发展具有一定联系,动态监测上述水平有利于评估早产儿BPD病情发展,并为临床实践中早期发现和干预BPD提供有价值的参考信息。

基于D-(-)-/L-(+)-对羟基苯甘氨酸的两对手性钴配合物的合成、晶体结构和电化学识别

采用常温溶液挥发法,以D-(-)-/L-(+)-对羟基苯甘氨酸(D-/L-Hhpg)为主配体,2种含氮吡啶配体4,4'-联吡啶(4,4'-bipy)和5,5'-二甲基-2,2'-联吡啶(5,5'-BM-2,2'-bipy)为辅助配体,与Co Cl_(2)·6H_(2)O反应合成了2对手性配合物{[Co(D-hpg)(4,4'-bipy)(H_(2)O)]Cl·H_(2)O}_(n )(1-D)、{[Co(L-hpg)(4,4'-bipy)(H_(2)O)]Cl·H_(2)O}_(n )(1-L)、[Co(D-hpg)_(2)(5,5'-BM-2,2'-bipy)]Cl·5.5H_(2)O (2-D)、[Co(L-hpg)_(2)(5,5'-BM-2,2'-bipy)]Cl·5.5H_(2)O (2-L)。通过单晶X射线衍射、元素分析、红外光谱、粉末X射线衍射等多种测试方法对其结构进行分析和表征。配合物的单晶X射线衍射数据表明,配合物1-D和1-L属于单斜晶系,P2_(1)手性空间群,分别呈现1D左手螺旋链和右手螺旋链,通过4,4'-bipy分子扩展为2D网状矩形格子结构。配合物2-D属于单斜晶系,P2_(1)手性空间群,为0D小分子,在氢键的作用下形成1D超分子双链,并以ABAB形式在a轴方向堆积排布。这些配合物的结构差异归因于辅助配体和Hhpg配位模式的影响。此外,还研究了配合物的电化学性质。配合物1-D表现出电化学可逆的氧化还原行为,并可作为电化学传感器用于有效地检测组氨酸对映体和定量测定组氨酸混合物中的对映体过量。

强化厌氧表达dld基因以提高大肠杆菌工程菌发酵产L-乳酸的光学纯度

为去除廉价发酵原料中的D-乳酸从而提高发酵最终产物L-乳酸的光学纯度,该研究通过构建带有不同厌氧诱导启动子(pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB)的D-乳酸脱氢酶基因(dld)的表达质粒,并将其分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)HBUT-L,加强其在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。通过装液量与转速的单因素试验筛选最优的质粒表达条件及菌株,并在无机盐培养基与玉米浆培养基中进行发酵验证。结果表明,在装液量为200 mL/250 mL、转速为150 r/min的条件下,含有启动子pflBp6-pnirB的表达质粒的工程菌株HBUT-L4发酵18 h时D-乳酸脱氢酶活力最高,为81.1 U/g。在此条件下进行无机盐培养基和玉米浆培养基发酵时,工程菌株HBUT-L4相对于出发菌株HBUT-L,D-乳酸消耗速率分别提高250%、217%,L-乳酸的光学纯度分别从96.32%、98.48%提升至99.95%、99.98%。在大肠杆菌工程菌发酵L-乳酸的过程中,带有厌氧诱导启动子pflBp6-pnirB的表达质粒可提高D-乳酸脱氢酶活力,强化菌株消除外源D-乳酸,进而提高L-乳酸的光学纯度的能力,具有重要的工业化应用价值。

高效液相色谱测定D,L-对羟基苯甘氨酸

建立了乙醛酸为原料合成D,L-对羟基苯甘氨酸反应体系的分析方法,采用高效液相色谱法(HPLC)测定,以ZORBA Eclipse Plus C_(18)色谱柱(4.6×250 mm,5μm)为色谱柱,水/甲醇为流动相梯度洗脱,探讨了各种色谱条件对分离度的影响,在优化后的色谱条件下(流速为0.8 mL·min^(-1),柱温为25℃,检测波长为254 nm),D,L-对羟基苯甘氨酸与杂质A分离度大于1.5,D,L-对羟基苯甘氨酸的线性方程为y=7 602.4x+254.55,线性相关系数0.999 6,检出限(S/N=3)为0.05 mg·kg^(-1),测定下限(S/N=10)为0.18 mg·kg^(-1)。加标回收率为93.4%~101.0%,相对标准偏差(n=6)为0.7%~2.0%。该方法与薄层色谱(TLC)测定结果基本一致,但更为简单,且灵敏度高。

L-阿拉伯糖异构酶催化生物合成D-塔格糖的制备及应用研究进展

D-塔格糖(D-tagatose)是一种稀有的天然六碳酮糖,是D-半乳糖同分异构体、D-果糖C-4位置上的差向异构体,学术界把这类天然存在较为罕见的单糖称为稀有糖。本文简要介绍了生物催化法合成D-塔格糖的研究背景和意义、D-塔格糖的物理化学性质和生理功能,并重点介绍了生物合成D-塔格糖主要的生物酶L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase,L-AI)的性质及结构和L-阿拉伯糖异构酶N-糖基化分子改良,并对未来D-塔格糖的生物合成研究做出展望,以期为D-塔格糖进行工业产业化提供参考价值。

HPLC法同时测定黄花蒿水提浸膏中青蒿素、青蒿乙素、猫眼草黄素和猫眼草酚D的含量

目的建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定黄花蒿水提浸膏中青蒿素、青蒿乙素、猫眼草黄素、猫眼草酚D的含量。方法采用Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;流动相:乙腈(A)-纯水(B),梯度洗脱;体积流量:0.8 mL·min^(-1);柱温:30℃;进样量:10μL;检测波长:210 nm。结果青蒿素、青蒿乙素、猫眼草黄素和猫眼草酚D进样量分别在1.6088~16.088μg(r=0.9999)、0.0141~0.1414μg(r=1)、0.1851~1.8509μg(r=0.9999)、0.1441~1.4414μg(r=0.9999)范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均加样回收率(n=6)分别为102.44%、97.82%、95.07%、95.55%,RSD分别为1.12%、1.44%、1.29%、1.53%。结论该方法简便准确、可靠稳定、重复性好,可用于同时测定黄花蒿水提浸膏中青蒿素、青蒿乙素、猫眼草酚D、猫眼草黄素的含量。

乳腺癌前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平与前哨淋巴结转移的关系及意义

目的探讨乳腺癌前哨淋巴结中八聚体结合转录因子-4(Oct-4)、血管内皮生长因子-D(VEGF-D)、L-选择素(L-selectin)水平与前哨淋巴结转移(SLNM)的关系及意义。方法选取2020年4月—2022年7月收治的147例乳腺癌,根据SLNM情况分为SLNM组67例、无SLNM组80例,比较2组及不同T分期、区域淋巴结分期患者前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平,采用多因素Logistic回归分析寻找乳腺癌SLNM的危险因素,采用决策曲线分析(DCA)和临床影响曲线(CIC)分析前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin评估SLNM的临床效用和与实际情况的符合度。结果SLNM组前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平高于无SLNM组(P<0.01)。随着T分期和区域淋巴结分期升高,前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin均是乳腺癌患者SLNM的独立危险因素(P<0.01);绘制DCA曲线显示,前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin评估乳腺癌患者SLNM均有正向的净获益,临床效用排序:Oct-4、L-selectin、VEGF-D,三者联合较单独指标评估的临床获益度均明显升高;绘制CIC显示,阈概率值>0.6时,三者联合评估SLNM与实际情况具有较高的符合率。结论乳腺癌前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平与SLNM及肿瘤分期有关,是患者发生SLNM的一个潜在机制,三者联合评估SLNM具有良好的临床获益度,可作为评估乳腺癌患者SLNM的可靠方法。

基于β-环糊精修饰的碳量子点对D,L-色氨酸的识别和L-色氨酸定量分析

目的建立基于β-环糊精(β-CD)修饰碳量子点(CQDs)的D,L-色氨酸(D,L-Trp)手性药物识别荧光分析方法,并实现L-色氨酸(L-Trp)的定量分析。方法以碳纤维为碳源,采用硝酸氧化法制备CQDs,利用EDC/NHS化学偶联法将乙二胺-β-CD修饰到CQDs表面,成功制备β-CD/CQDs复合物,构建D,L-Trp对映体手性识别荧光传感器。采用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、红外光谱及X射线电子能谱等技术评价CQDs及β-CD/CQDs复合物的理化性能,并进行合成与识别条件优化。结果在pH值为5.5或6.0和反应温度为40℃的条件下,β-CD/CQDs复合物能够很好地识别D,L-Trp手性,且L-Trp在6~38μmol/L与荧光强度呈良好线性关系(r=0.998),检测限为0.94μmol/L。结论建立的手性药物识别荧光方法具有良好的特异性,能够实现对D,L-Trp的识别以及对L-Trp的定量分析。

左旋紫草素抑制NF-κB信号通路保护LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤

目的探讨左旋紫草素(L-Shikonin,L-SK)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞的体外抗炎作用及其对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤的保护作用。方法体内实验采用LPS/D-GalN建立小鼠急性肝损伤模型,考察存活率和各组小鼠的肝脾指数变化,测定血清中AST、ALT、AKP与肝组织匀浆中的NO含量、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平,HE染色观察各组小鼠肝组织病理切片。体外实验采用MTT法检测细胞存活率、Griess法检测NO含量、RT-PCR和Western blot检测分别考察L-SK对LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎因子的mRNA和相关通路蛋白表达水平的影响。结果体内实验结果表明,L-SK可明显改善急性肝损伤小鼠的肝脾指数,血清中AST、ALT和AKP水平明显下降,肝匀浆中的NO和MDA含量明显下降,SOD活性提高,能明显改善小鼠肝组织病理性损伤。体外实验结果表明,L-SK能明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中的INOS、COX2、IFN-β以及促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA表达,并且明显抑制INOS、COX2蛋白表达以及NF-κB信号通路蛋白表达。结论L-SK在LPS诱导的RAW264.7细胞的体外炎症中具有良好的抗炎作用,通过抑制NF-κB信号通路中的磷酸化p65以及IKKα/β的蛋白表达,从而发挥体外抗炎作用,同时L-SK对小鼠急性肝损伤具有保护作用,其作用机制可能与抗炎作用相关。

线形聚(D,L-乳酸)和星形聚(D,L-乳酸)的合成研究

在辛酸亚锡Sn(Oct)_(2)催化下,分别用丙炔醇和季戊四醇引发D,L-丙交酯(DLLA)的开环聚合(ROP),合成了具有末端炔基的线形聚(D,L-乳酸)(PDLLA)和四臂星形聚(D,L-乳酸)(S-(PDLLA)4),通过核磁共振氢谱(^(1)H NMR)和凝胶渗透色谱(GPC)对聚合物的结构和相对分子质量进行了表征。合成产物可用于后续制备基于聚乳酸的两亲性嵌段共聚物,为生物可降解性高分子材料的开发应用提供实验依据。

产L-阿拉伯糖异构酶基因工程菌的构建及优化

L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)可专一性的作用于底物D-半乳糖,生成D-塔格糖。为获得高产L-AI的菌株,将来源于短乳杆菌L.brevis sp. D-tag 1的L-AI编码基因araA基因连接到pET-30a(+)表达质粒中构建重组质粒,并将重组质粒通过热激法转入E.coli BL21(DE3),构建得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-araA。根据宿主大肠杆菌的密码子偏好性,对araA基因进行密码子优化,并将优化的araA_o基因连接到pET-30a(+)表达质粒中构建重组质粒,采用相同的方法构建得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-araA_(o)。结果表明,在相同培养条件下,优化后的菌株较未优化的表达量有明显提高,酶活提高了79.2%。

反相高效液相色谱法测定Fmoc-L-His(Trt)-OH中光学异构体Fmoc-D-His(Trt)-OH的含量

目的结合外标法和面积归一化法,建立反相高效液相色谱法测定Fmoc-L-His(Trt)-OH中的光学异构体Fmoc-D-His(Trt)-OH的含量。方法采用Chiral MX(2)-RH色谱柱(4.6 mm×250mm,5μm);以乙腈-水-乙酸(500∶500∶1)为流动相,等度洗脱;流速为0.8 mL·min^(-1);紫外检测器检测,波长为220 nm;柱温为30℃;进样体积为10μL。结果Fmoc-L-His(Trt)-OH和Fmoc-D-His(Trt)-OH分离良好;Fmoc-D-His(Trt)-OH在0.15~2.93 mg·mL^(-1)与峰面积呈良好的线性关系(相关系数为0.9999);定量限为0.15μg·mL^(-1),检测限为0.049μg·mL^(-1)。回收率在95%~100%内,RSD为0.96%。结论本方法操作简单,专属性强,灵敏度高,为Fmoc-L-His(Trt)-OH中光学异构体Fmoc-D-His(Trt)-OH研究提供参考。

多粘类芽孢杆菌中L-阿拉伯糖异构酶的克隆表达及固定化研究

为了对D-半乳糖进行异构化制备D-塔格糖,从多粘类芽孢杆菌KF-1中克隆L-阿拉伯糖异构酶基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达;重组蛋白PpoLAI通过镍柱纯化,并利用壳聚糖微球进行固定化研究。结果表明:使用D-半乳糖作为底物时,PpoLAI的最佳温度和pH分别为50℃、7.0;Mn^(2+)显著激活酶活性,当Mn^(2+)的浓度为0.8 mmol/L时,PpoLAI的活性最高;以D-半乳糖为底物的PpoLAI的米氏常数和分别为161.4 mmol/L及98.84μmol/(mg·min);PpoLAI的最优固定化条件为壳聚糖的质量分数为3%,戊二醛的体积分数为3%,游离酶添加量为0.9 mg/g,吸附温度为25℃,吸附时间为4 h,PpoLAI的固定化率为80.12%,固定化的PpoLAI的热稳定性、pH稳定性与游离酶相比有显著提升。

厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

【目的】为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题。【方法】构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5和HBUT-D7。通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵。【结果】HBUT-D7的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株。以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率分别为10.41 mg/(L·h)及34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为4.24 g/(L·h)及3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.07%及99.92%。以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为1.93 g/(L·h)及1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.22%及99.99%。【结论】厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度。

D,L-氨基酸和二肽甜味剂产业化技术

简述D,L-苯丙氨酸,D,L-丙氨酸和L-天冬氨酸的基本属性、制备途径;并以此为原料合成二肽甜味剂阿斯巴甜、阿力甜和乐甜,以实现其产业化。

有机锡化合物引发D,L-丙交酯的开环聚合

D,L-丙交酯在有机锡化合物四苯基锡（Ph4Sn）、三正丁基醋酸锡（Bu3SnOAc）、辛酸亚锡（SnOct2）等催化剂引发下开环聚合,得到高分子量的聚D,L-乳酸,讨论了聚合单体D,L-丙交酯纯度、聚合温度、聚合时间、聚合体系真空度以及引发剂有机锡催化剂与聚合单体D,L-丙交酯的比例对聚D,L-乳酸合成的影响,通过红外光谱和核磁共振光谱对聚D,L-乳酸的结构进行了表征.实验结果表明,D,L-丙交酯开环聚合反应的较佳工艺路线是：D,L-丙交酯重结晶5次,聚合温度140 ℃,聚合时间24 h,聚合体系真空度13.3～133.3 Pa,引发剂有机锡催化剂与单体D,L-丙交酯比例0.2‰～0.5‰,此时聚D,L-乳酸的粘均分子量最高,分别达到32.46×10^4,33.43×10^4和41.36×10^4.

2,4-D丁酯对罂粟(Papaver somniferum L.)保护酶活性及脂质过氧化作用的影响

罂粟(Papaver somniferum L.)花蕾期用不同浓度的2,4-D丁酯对植株进行处理,测定了4d中叶片相对含水量(RWC)、丙二醛(MDA)含量、膜相对透性及保护酶(SOD、POD)活性变化情况。结果表明:在1ml/L、2ml/L、4ml/L浓度处理下对罂粟叶片RWC影响不显著,8ml/L处理下的RWC随处理时间的延长呈显著下降趋势,第4天比第1天下降了48.7%。在各处理下MDA含量和膜相对透性的变化趋势基本一致,1ml/L、2ml/L、4ml/L处理前期下降,后期升高。8ml/L处理对MDA含量和膜相对透性的影响显著的高于其它处理,随处理时间的延长呈先升高后降低的趋势。保护酶在处理条件下随时间延长其活性有明显的变化:POD活性变化波动较大,除8ml/L外其它处理在第2、第4天有两次上升峰,8ml/L峰值出现在第2天,之后下降在第4天达最低。SOD活性先降低后升高,都高于对照,所有处理SOD活性在第3d最低,第4天8ml/L处理的活性显著的高于其它处理。表明了高浓度(8ml/L)的2,4-D能使膜脂过氧化而产生较大的损伤,其它浓度处理对膜脂过氧化及膜透性影响相对较小,表明8ml/L的2,4-D是灭杀罂粟的最适用量。

模压挤出条件对聚(D,L-乳酸)及其复合材料力学性能的影响

在辛酸亚锡的催化下由丙交酯开环聚合制备了聚 ( D,L) -乳酸 ( PDL L A) ,并用二苯基甲烷二异氰酸酯( MDI)作为扩链剂分别合成了 MDI扩链聚 ( D,L) -乳酸 ( PDL L A/ MDI)和 MDI扩链聚 ( D,L) -乳酸 /羟基磷灰石( PDL L A/ HA/ MDI)复合材料。采用自行设计的模压挤出设备着重研究了成型加工条件对这两类可生物降解材料力学性能的影响。实验结果表明 ,在最佳条件下 PDL L A和 PDL L A/ MDI的弯曲强度分别为 3 5 .1MPa和 5 1.3MPa,弯曲模量分别为 2 413 .6MPa和 183 0 .9MPa,PDL L A/ HA和 PDL L A/ HA/ MDI复合材料的弯曲强度分别为 3 1.2 MPa和 5 5 .4MPa,弯曲模量分别为 173 5 .0 MPa和 2 0 68.5 MPa,可见 ,MDI扩链可显著提高 PDL L A和PDL L A/

图的L(d,1,1)-标号

给出了图L(d,1,1)-标号的一般性质.对一般图G,给出了构造L(d,1,1)-标号的一个算法,证明了λd,1,1(G)≤Δ3-Δ2+dΔ.对最大度Δ的树T,证明了d+Δ-1≤λd,1,1(T)≤d+2Δ-2,并且式中的上界与下界都是可达的.此外,对于两类特殊的树图:拟正则树TΔ及正则毛毛虫Catn,给出了确切的L(d,1,1)-标号数,其中d≥2.