谷氨酸脱羧酶(GAD)的研究进展

谷氨酸脱羧酶(GAD,EC4.1.1.15)是生物体内广泛存在的一种酶,有重要的生理学作用,能催化谷氨酸脱羧生成重要的抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)。GAD用于医疗和食品中具有很大潜力,本文综述了GAD的研究进展和应用。

大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶定点突变及其酶学性质初步研究

L-谷氨酸脱羧酶（L—glutamate decarboxylase，GAD）是生物法生产GABA的关键酶，但是野生型L-谷氨酸脱羧酶的最适pH过低，这限制了它的工业应用。本文对编码来源于大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的gadB基因进行了定点突变，分别构建了表达野生型GadB和突变型GadBAHT的基因工程菌。在获得高表达的基础上，对两个酶的最适温度、最适pH、温度稳定性和pH稳定性进行了系统研究，证实了突变酶GadBAHT在保持了与野生型相当的催化活性的前提下，表现出更广泛的pH适应能力，在pH3．4～6．2的范围内，仍能保持50％以上的催化活性。突变酶更能适应工业生产的需要，降低生产成本，对于实际应用具有重要价值。

针刺对抑郁大鼠海马GAD65、GAD67调控作用研究

目的:研究针刺治疗对抑郁模型大鼠海马谷氨酸脱羧酶65(GAD65)、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)的蛋白表达水平,探讨针刺疗法的抗抑郁作用及其相关作用机制。方法:将100只大鼠随机分成5组,空白对照组、氟西汀组、针刺非穴组、针刺穴位组以及模型组,各组均20只,采用慢性综合应激法建立抑郁模型,各组进行相应干预21 d,观察治疗前后大鼠行为学变化。并在实验结束后,从以上5组大鼠中,每组随机抽取8只,Western Blot法检测海马区GAD65、GAD67蛋白表达水平。结果:与空白组相比,实验21 d后,模型组、针刺组、非穴位针刺组的垂直运动次数明显减少,差异有非常显著性(P<0.01),模型组GAD65蛋白表达量降低,差异有显著性(P<0.05);与模型组相比,氟西汀组和针刺组体质量增幅较大、糖水摄入量明显增加、水平运动次数明显增加、垂直运动次数明显增加,差异有非常显著性(P<0.01),针刺穴位组GAD65蛋白表达量升高,差异有显著性(P<0.05);5组间GAD67蛋白表达水平差异无显著性(P>0.05)。结论:对慢性复合应激大鼠百会、三阴交以及内关等穴实施针刺,能够在一定程度上缓解其抑郁状态;穴位针刺的抗抑郁作用可能与增加GAD65合成、减少海马谷氨酸(Glu)含量、增加γ-氨基丁酸(GABA)含量有关。

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

【目的】克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础。【方法】根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系"新-9-4"的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体。【结果】扩增获得长1962bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%。OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD基因分别位于此载体的两个不同T-DNA区。【结论】克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体。

芜青中谷氨酸脱羧酶(Gad)酶性质的时空差异

该文对芜青中谷氨酸脱羧酶(Gad)粗酶的提取和优化、酶活力最适反应条件、时空分布差异及光照影响等进行对比分析,同时利用超高效液相色谱法技术(UPLC)分析测定反应产物γ-氨基丁酸(Gaba)的含量.实验结果表明,提取Gad粗酶时加入纤维素酶能提高约70%酶活力.在最适条件对比实验中,对芜青芽苗、块根、茎生长点、茎及顶端分生组织分别进行测定,其中芽苗与顶端分生组织中的酶活力较高.光照对萌发中芽苗的Gad酶活力有较大影响,避光条件下酶活力下降约75%.结果表明,芜青芽苗Gad酶活力好且易于获取,转化谷氨酸反应生成γ-氨基丁酸的转化率高.

慢性自身免疫性甲状腺炎少年儿童中胰岛β细胞自身抗体（GAD）的阳性率分析

目的探讨慢性自身免疫性甲状腺炎患者中的抗胰岛细胞自身免疫状态。方法用ELISA方法定量检测谷氨酸脱羧酶抗体,将慢性自身免疫性甲状腺炎学龄患儿的抗GAD抗体的频率和健康年对照组相比。结果 41例慢性自身免疫性甲状腺炎患者中4例（9.8%）为GAD抗体阳性。慢性自身免疫性甲状腺炎组GAD阳性率明显高于对照组,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论研究发现,在自身免疫性甲状腺炎患者中GAD抗体阳性率较高。我们的发现支持了自身免疫性甲状腺疾病患者在未来生活中可能发展为1型糖尿病的概念。

介导GAD基因的人泡沫病毒载体的构建及其应用

构建了两种新的重组人泡沫病毒载体pGPSNI-hGAD67和pGPSNI-hGAD65,分别携带人谷氨酸脱羧酶(GAD)的两种同工酶GAD65和GAD67基因,并研究其在帕金森病(PD)模型鼠丘脑底核中的表达及对帕金森病的治疗作用.RT-PCR结果表明,人泡沫病毒载体成功地介导了GAD65基因和GAD67基因在PD模型鼠丘脑底核中有效表达.动物行为检测表明,GAD65基因导入组PD模型鼠行为与对照组相比得到明显的改善(n=12,p<0.01).

Fmr1基因敲除小鼠耳蜗GAD的表达

目的对4周龄Fmr1基因敲除小鼠的耳蜗的GAD表达进行观察,探讨耳蜗GAD的表达是否受FMRP的影响。方法使用PCR技术对Fmr1基因敲除小鼠鉴定后对4周龄的Fmr1基因敲除小鼠和野生型小鼠各15只进行耳蜗的苏木精-伊红(HE)染色和GAD免疫组织化学的表达观察,数据采用多因素方差分析处理。结果耳蜗HE染色结果:4周龄组KO鼠较WT鼠形态学观察无差异。4周龄KO小鼠的耳蜗中GAD表达的平均阳性细胞数均高于WT小鼠,P<0.01,差异具有统计学意义。结论 GAD表达的改变可能与FMR1基因KO小鼠听源性惊厥发病有关。

鼠脑谷氨酸脱羧酶GAD_(65)基因的cDNA克隆

目的：从Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑中克隆谷氨酸脱羧酶ＧＡＤ６５的ｃＤＮＡ并进行序列分析。方法：用ＲＴＰＣＲ法扩增目的基因，酶切鉴定后，将特异性ＤＮＡ片段重组入质粒载体中，双脱氧末端终止法测定其全部核苷酸顺序。结果：克隆的特异性ＤＮＡ片段为编码５８５个氨基酸、含终止密码子在内的共１７５８ｂｐ的ＧＡＤ６５全编码序列。经重复实验，与ＥＭＢＬ核酸数据库提供的大鼠ＧＡＤ６５基因比较，发现第５７９位碱基由ＡＴ，并产生一新的ＰｖｕＩ酶切位点，但这种变化不涉及氨基酸的改变。结论：获得鼠脑谷氨酸脱羧酶ＧＡＤ６５基因的全长ｃＤＮＡ，为该基因的体外表达打下基础。

羟基马桑毒素及其衍生物对粘虫体内GAD和GABA-T活性的影响

为了探明羟基马桑毒素及其衍生物(T1、T2、T3、T4)对粘虫神经系统的影响以及快速检测对比分析新合成的药物对试虫神经递质γ-氨基丁酸(GABA)相关酶谷氨酸脱羧酶(GAD)和γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)活性的影响,通过胃毒和离体2种处理方式提取粗酶液并采用分光光度法对试虫酶活性进行测定。结果表明,经羟基马桑毒素及其衍生物处理后试虫的GAD酶活受到了抑制,而GABA-T活性被提高,这2种酶影响着试虫体内GABA的含量。离体测定的结果与胃毒处理后试虫体内酶活的变化相似,因此可以采用离体处理方法快速检测新药物对试虫的活性。

抗谷氨酸脱羧酶65抗体相关性僵人综合征并自身免疫性多内分泌腺病综合征Ⅱ型1例并文献复习

目的报告1例抗谷氨酸脱羧酶65抗体相关性僵人综合征(SPS)并发自身免疫性多内分泌腺病综合征Ⅱ型(APS-Ⅱ)的病例,旨在提高临床医师对该病的认识。方法回顾性分析2022年安徽省某神经病学研究所附院收治的1例51岁女性,临床以反复腰痛、腰腹及双下肢僵硬伴无力为特点的病例资料,并复习相关文献。结果患者临床以反复腰痛、腰腹及双下肢僵硬伴无力为特点,早期误诊为分离转换障碍,后检查发现血清及脑脊液抗谷氨酸脱羧酶65抗体阳性,甲状腺球蛋白抗体及过氧化酶抗体滴度升高,空腹及餐后2 h血糖、糖化血红蛋白升高,神经电生理提示静息状态下以体轴肌为主的连续性运动单位电位发放,诊断为抗谷氨酸脱羧酶65抗体相关性SPS、APS-Ⅱ(桥本甲状腺炎、1型糖尿病),予免疫治疗和对症治疗后病情改善。结论抗谷氨酸脱羧酶65抗体相关性SPS并发APS-Ⅱ临床虽具有一定特异性,但由于临床罕见,易误诊、漏诊,尤其是病程早期。

巨胚水稻W025糙米浸水后γ-氨基丁酸含量变化的研究

富含γ-氨基丁酸(GABA)的降血压功能水稻正受到越来越多的关注。W025是通过化学诱变和杂交选育而成的水稻新品系,具有巨胚特征,遗传分析表明巨胚基因受单隐性基因控制。进一步研究W025和其原始品种金南风浸水后γ-氨基丁酸(GABA)含量及其合成关键酶———谷氨酸脱羧酶活性的动态,并用半定量RT-PCR检测了2个谷氨酸脱羧酶转录本在浸水过程的表达变化。结果表明,(1)GABA主要集中在胚部,浸水后W025的GABA积累量显著高于金南风。(2)随着浸水时间延长,谷氨酸脱羧酶(GAD)的活性呈逐渐增加趋势,W025胚部的酶活性显著高于金南风。GAD活性的变化与GABA的积累呈显著正相关,表明浸水后种胚GABA的积累与谷氨酸脱羧酶的催化反应有关。(3)2个谷氨酸脱羧酶基因OsGAD1与OsGAD2在W025和金南风之间没有转录水平的差异。提示可能存在其他的谷氨酸脱羧酶基因对浸水后GABA的积累起关键作用。

发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的品种基因型差异分析

【目的】通过对不同类型水稻品种发芽糙米中γ-氨基丁酸(GABA)含量和谷氨酸脱羧酶(GAD)活性、谷氨酸转化速率等指标差异的比较分析,探讨不同品种发芽糙米中GABA含量差异形成的原因,为发芽糙米的品质选育及其深加工利用提供依据。【方法】以181份水稻品种(系)糙米为材料,在30℃条件下浸泡6 h、发芽24 h后,测定GABA含量;在此基础上,选取高GABA产量材料10份及中、低产量材料各1份,对其发芽糙米的GABA产量、GAD活性、谷氨酸转化速率、游离谷氨酸含量、根长和芽长的动态变化进行了分析。【结果】不同水稻品种(系)发芽糙米的GABA含量存在明显差异,最高达87.88 mg.(100 g)-1,最低为34.62 mg.(100 g)-1,平均含量为56.84 mg.(100 g)-1;早稻品种的GABA含量显著高于中稻和晚稻,籼稻稍高于粳稻;高GABA生成量的性状是可遗传的。发芽糙米的GABA生成量与芽长和GAD的活性呈极显著的正相关。【结论】水稻发芽糙米的GABA含量存在明显的生态型差异,其变化可能是由不同品种间的GAD酶活性差异所致。

比色法快速测定乳酸菌谷氨酸脱羧酶活力及其应用

基于Berthelot显色测定ω 氨基酸的反应 ,探讨了比色法快速测定谷氨酸脱羧酶活力的测定条件。结果表明 ,该方法灵敏度较高 ,重现性好 ,成本低 ,快捷 ,可替代氨基酸分析仪分析法。对乳酸菌谷氨酸脱羧酶提取液的适宜反应底物体系为 0 2mol LMacIlvaine ,pH4 7,内含 0 1mmol LPLP (5 磷酸吡哆醛 ) ,1 0mmol L底物L MSG (L 谷氨酸钠 )。 2 0 0 μL底物溶液和 1～ 1 0 0 μL酶液在 3 0℃反应 ,然后冰浴中加入 2 0 0 μL 0 2mol L硼酸缓冲液 (pH9 0 )终止反应 ,再加入 1mL 6%苯酚和 40 0 μL次氯酸钠 ,沸水浴加热 1 0min后 ,迅速冷却 2 0min ,在 63 0nm测定吸光值 ,酶反应产物γ 氨基丁酸的定量以标准曲线确定 。

谷氨酸脱羧酶抗体和胰岛细胞抗体在IDDM诊断中的价值

用放射免疫法测定７９例胰岛素依赖型糖尿病（ＩＤＤＭ）和５３例非胰岛素依赖型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）病人的血清谷氨酸脱羧酶（ＧＡＤ）抗体，用ＥＬＩＳＡ法测定ＩＤＤＭ组的胰岛细胞抗体（ＩＣＡ）和胰岛素抗体（ＩＡＡ）。结果ＩＤＤＭ组ＧＡＤ抗体的阳性率为４６．８％，初发ＩＤＤＭ（病程不超出１年）与病程超出１年的ＧＡＤ抗体阳性率分别是６２．９％和３４．１％。ＮＩＤＤＭ及正常对照组未见阳性的ＧＡＤ抗体。ＩＣＡ和ＩＡＡ阳性率分别为４９．４％、２４．３％。ＧＡＤ和ＩＣＡ两项同时测定的阳性率达７３．７％。提示ＧＡＤ与ＩＣＡ结合使用，可以提高ＩＤＤＭ的检出率。

Lactococcus lactis谷氨酸脱羧酶的分离纯化及部分酶学性质

采用溶菌酶处理、超声破碎、硫酸铵分级、3次DEAE SepharoseCL 6B层析、SephacrylS 200凝胶过滤等手段,从乳酸菌细胞中分离纯化得到谷氨酸脱羧酶(GAD;EC4.1.1.15).纯化酶的比活力为14.4U/mg,纯化倍数31,回收率3.8%,SDS PAGE得到亚基的相对分子质量为65000.L 谷氨酸是测试的18种氨基酸中的惟一作用底物,表明乳酸菌GAD具有高度的底物专一性.酶在pH值3.6～5.4时具有活性,pH值4.7时活性最高,pH值6.0以上时没有活力.耐热性实验表明,pH值4.7条件下处理5h后,60℃时该酶仍能保持80%以上的活性,80℃以上迅速失活,由Lineweaver Burk作图得到的GAD的Km值为1.9mmol/L.

酶法制备D-谷氨酸和γ-氨基丁酸的工艺研究

考察了大肠杆菌AS1.505的L谷氨酸脱羧酶对L谷氨酸的专一脱羧作用,分析了转化体系温度、pH值等因素对L谷氨酸脱羧酶活力的影响。实验结果表明最佳工艺为:温度37℃,转化体系pH值4.8,菌体浓度6g/L,吐温800.15g/L,菌龄14h,底物浓度50g/L。L谷氨酸脱羧酶在最适转化条件下比酶活可以达到15036U。1g湿菌体可重复使用3次共转化DL谷氨酸25g,其中L谷氨酸可以完全转化为γ氨基丁酸。D谷氨酸及γ氨基丁酸的总收率可以分别达到理论收率的87%和85%。

乳酸菌谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究

本文对一株乳酸菌所产谷氨酸脱羧酶的酶学性质进行了较系统的研究,其中包括酶的热稳定性、pH稳定性及温度、pH和一些化学物质对酶活的影响。结果表明:此酶的最适温度为52℃,最适pH为4.5,米氏常数Km=24mmol。PLP、VB6及Ca2+在一定程度上都能促进酶活,且在含量小于100μmol时,作用程度为PLP>VB6>Ca2+。乙酸浓度小于0.05mol/L也能提高酶活力。

影响壳聚糖固定化谷氨酸脱羧酶的因素

以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,制备固定化谷氨酸脱羧酶(GAD),并研究固定化反应中各个因素对固定化GAD活力的影响。结果表明,壳聚糖固定化谷氨酸脱羧酶的最佳条件为:戊二醛质量分数3%,处理时间16～24h,处理温度40℃,酶吸附温度4℃、酶吸附时间24h以上,给酶量为70.8mg/g壳聚糖。

生产γ-氨基丁酸乳酸菌的选育及发酵条件优化

通过对食品安全级 (GRAS)乳酸菌的筛选 ,得到一株可高产谷氨酸脱羧酶的菌株。并且对菌株的发酵培养基与发酵条件进行了优化。结果表明 :采用优化后的培养基 ,调初始pH为 7.0 ,在 33℃进行发酵培养 3d后 ,发酵液中GABA含量可达到31 0g·L-1 以上 ,比优化前提高了约