高产L-丙氨酸大肠杆菌细胞工厂的构建与发酵优化

L-丙氨酸作为最小的手性化合物之一,被广泛应用于食品、医药和日化领域。目前,微生物法生产L-丙氨酸存在发酵周期长,生产强度低等问题。为此,通过强化前体供给、启动子工程和转运工程等代谢工程策略,构建高产L-丙氨酸的大肠杆菌细胞工厂。进一步通过生化工程策略优化L-丙氨酸生产工艺,提高L-丙氨酸大肠杆菌细胞工厂的生产性能。结果:过表达gapA(3-磷酸甘油醛脱氢酶基因)强化前体丙酮酸供给,使L-丙氨酸产量和转化率分别提高了5.1%和15.6%。启动子工程优化gapA表达,使L-丙氨酸产量和转化率进一步提高到18.3 g/L和0.55 g/g。过表达L-丙氨酸外运蛋白(AlaE),增加L-丙氨酸转运,使L-丙氨酸产量提高到20.4 g/L。生化工程策略优化培养基组分,得到最佳碳源为葡萄糖40 g/L,最佳氮源为(NH4)2SO425 g/L。最佳发酵条件为:接种量15%,10 h转厌氧发酵和变速补料发酵。5 L发酵罐发酵36 h,大肠杆菌菌株W-135 L-丙氨酸产量为127.2 g/L,转化率为0.83 g/g,生产强度为3.53 g/L/h,比优化前分别提高了64.3%,50.9%和64.2%。本研究利用系统代谢工程和生化工程策略,构建了发酵周期短和发酵工艺简单的L-丙氨酸高产菌株,为L-丙氨酸的工业化生产提供了理论基础。

铋/锡催化L-丙交酯与乙交酯本体开环共聚

为探究金属催化剂辛酸亚锡(Sn(Oct)_(2))与次水杨酸铋(BiSS)对L-丙交酯(L-LA)与乙交酯(GA)本体开环聚合(ROP)反应过程及产物性能的影响,使用不同含量的Sn(Oct)_(2)或BiSS合成一系列聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)。通过核磁共振波谱仪、傅里叶变换红外光谱仪、凝胶渗透色谱仪对聚合物的微观结构、聚合反应动力学和相对分子质量进行了表征,借助热重分析仪和差示扫描量热仪对聚合物的热性能进行了分析。结果表明,BiSS是一种非常有吸引力的催化剂,在ROP制备PLGA共聚物中获得了与Sn(Oct)_(2)类似的结果,其催化性能可与Sn(Oct)_(2)相媲美。BiSS催化制备的PLGA的热稳定性显著提高,例如,1000×10^(-6)Bi催化制备的PLGA73在氮气氛围下的T_(5)%和T_(90)%分别为269.6℃和379.2℃,相较于Sn(Oct)_(2)分别升高了36℃和82.7℃。由BiSS催化制备的PLGA链段具有更高的随机性和更短的L-LA序列长度。BiSS可以替代商业使用的Sn(Oct)_(2)用于生产生物医学领域应用的低毒性PLGA。

L-乳酸合成L-丙交酯过程中的定量问题及其提高选择性的方法

聚乳酸(PLA)是一种很有前途的可降解、可再生和生物相容性的聚合物,L-丙交酯作为生产聚乳酸的重要中间体,其纯度直接影响聚乳酸的质量和生产成本。丙交酯通常采用气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)或核磁共振氢谱法(^(1)H NMR)定量。然而,发现GC在乳酸生产丙交酯的过程中并不适用于定量,丙交酯收率总是比LC高得多。详细的分析表明,一些在反应过程中没有完全转化的乳酸低聚物在高温下可以发生解聚生成丙交酯,从而使丙交酯的产率比实际的高。因此,LC是一种较为准确的丙交酯定量分析方法。基于这一现象,采用固定床反应器模拟GC分析的反应条件,大大提高了丙交酯的选择性和收率。优化后的反应条件可使丙交酯的最高收率达到100%。

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺对低氧胁迫后军曹鱼幼鱼生长性能、血清生化与抗氧化指标的影响

本试验旨在为探究L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Ala-Gln)对低氧胁迫后军曹鱼幼鱼生长性能、血清生化与抗氧化指标的影响。以低氧胁迫14 d后的军曹鱼幼鱼[(105.16±6.01)g]为研究对象,随机分为4组,每组3个重复,每个重复30尾。4组试验鱼分别投喂Ala-Gln添加量为0(对照组)、0.5%、1.0%、1.5%配制4种等氮等脂的试验饲料,并分别于试验第7、14、28天采集血清进行指标测定。结果显示:1)与对照组相比,在饲喂14与28 d时,1.0%组和1.5%组的增重率和特定生长率显著升高(P<0.05),饲料系数显著降低(P<0.05)。2)与对照组相比,在饲喂28 d时,1.0%组和1.5%组血清中甘油三酯和总胆固醇含量显著降低(P<0.05),所有添加Ala-Gln组血清中葡萄糖、总蛋白和白蛋白含量显著升高(P<0.05),1.5%组血清中谷草转氨酶与谷丙转氨酶活性显著升高(P<0.05)。3)与对照组相比,在饲喂28 d时,1.0%组和1.5%组血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高(P<0.05),血清丙二醛含量显著降低(P<0.05)。以上结果表明,饲料中添加1.0%Ala-Gln可提高军曹鱼幼鱼血清中TP和ALB的含量以及减少血清中TC和TG的堆积,提高生长性能与抗氧化能力,改善低氧胁迫所带来的氧化损伤。

HPLC法测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中L-丙氨酸的含量

建立测定L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中L-丙氨酸含量的反相高效液相色谱法。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XBridge shield C18,4.6 mm×250 mm,5μm)的色谱柱,流动相为乙腈-0.02 mol/L辛烷磺酸钠(用磷酸调节pH至2.5)(V∶V=25∶75),流速0.5 mL/min,检测波长210 nm,柱温30℃。定量限为0.72μg/mL(相当于样品浓度的0.024%),检测限为0.24μg/mL。L-丙氨酸在0.72~225μg/mL浓度范围内,线性方程为Y=619.7733X-157.8515,r=1.0000>0.999。回收率为100.8%~104.9%(RSD<10.0%,n=9)。该方法操作简便、专属性强、灵敏度高,可有效检出L-丙氨酸异丙酯盐酸盐中杂质L-丙氨酸的含量。

系统代谢工程改造谷氨酸棒杆菌高产L-丙氨酸

L-丙氨酸是一种重要的天然氨基酸,广泛应用于医药、食品、饲料等领域。目前,L-丙氨酸主要通过大肠杆菌来生产,开发安全、工业稳定的谷氨酸棒杆菌生产菌株具有重要的意义。该研究筛选了外源丙氨酸脱氢酶,在不以其他氨基酸为氨基供体的条件下高效率合成L-丙氨酸。强化非磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)葡萄糖摄取途径,极大地促进了细胞的生长和L-丙氨酸的合成。引入异源Entner-Dondoroff途径,通过4步反应即可实现糖酵解途径10步反应供应前体物丙酮酸,进一步提高了L-丙氨酸的产量。此外,为了避免抗生素的使用和保证菌株的遗传稳定性,将关键基因整合到基因组上。最终工程菌株在5 L发酵罐发酵48 h产生104 g/L L-丙氨酸。该研究为利用谷氨酸棒杆菌工业化生产L-丙氨酸奠定了基础,同时为其他丙酮酸族产品的代谢工程研究提供了参考。

大肠杆菌胞内L-丙氨酸响应型启动子的筛选与表征

该研究通过对L-丙氨酸压力下大肠杆菌的转录组进行分析,利用mKate荧光蛋白进行表征,筛选响应L-丙氨酸的启动子元件。转录组筛选了ArgK、FlgG、GlgP、CpxP、BetA、GlpA、KdpB、PulG、LivH和YhfX十个在L-丙氨酸压力下转录水平显著提高的基因,并将基因前500 bp潜在的启动子片段与荧光报告蛋白基因m Kate融合,筛选得到特异性响应L-丙氨酸浓度的启动子PAla-7。结果表明,PAla-7启动子在10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L和60 g/L L-丙氨酸诱导后的相对荧光强度分别增加了49%、122%、181%、275%、432%和705%,表明PAla-7启动子在L-丙氨酸质量浓度0~60 g/L范围内有着良好的灵敏性。选择11种常见氨基酸诱导PAla-7启动子表达,只有L-丙氨酸在诱导质量浓度从10 g/L增加到20 g/L时,相对荧光强度增加了52.4%,表明PAla-7启动子是特异性响应L-丙氨酸的启动子。

L-丙交酯/meso-丙交酯的共聚反应及其产物性能

为研究工业化生产中左旋(L-)丙交酯和内消旋(meso-)丙交酯的聚合反应及产物性能,通过对L-丙交酯进行高温热处理制备更加符合工业生产的meso-丙交酯,并以L-丙交酯和meso-丙交酯为聚合单体,探究丙交酯性质对开环聚合反应产物的分子量及其性能的影响。借助凝胶渗透色谱仪、核磁共振波谱仪、傅里叶红外光谱仪、热重分析仪、差示扫描量热仪和二维X射线衍射仪分析了聚乳酸共聚产物的分子量、化学结构、热性能和结晶性能。结果表明:含有0~5.0%meso-丙交酯的L-丙交酯可以成功进行开环聚合得到聚乳酸共聚物,并且meso-丙交酯的存在不会显著影响聚合物分子量的分布均一性。随着meso-丙交酯含量的增加,聚乳酸的热分解温度、玻璃化转变温度、熔点和熔融焓等热性能参数均明显降低。与聚左旋乳酸(PLLA)相比,共聚物的结晶速度与结晶能力降低,二者的最佳结晶温度均在100℃左右。meso-丙交酯的加入使共聚物大分子链的有序化程度降低,但不会改变聚乳酸的晶体结构。

L-丙氨酰-L-酪氨酸标准样品研制

根据GB/T 15000标准样品工作导则,研制L-丙氨酰-L-酪氨酸标准样品。经制备液相方法纯化得到的L-丙氨酰-L-酪氨酸标准样品,通过UV、IR、MS和NMR等方法进行结构鉴定,并进行均匀性、稳定性检验,最后采用质量平衡法和核磁共振法进行定值。L-丙氨酰-L-酪氨酸标准样品均匀性和稳定性良好,其定值结果为99.21%,置信度95%的扩展不确定度为0.46%。所制备的L-丙氨酰-L-酪氨酸样品满足标准样品工作导则的要求,可以用于L-丙氨酰-L-酪氨酸相关产品的方法验证和质量控制。

L-丙氨酸乙酯还原反应的研究

对L-丙氨酸乙醣的还原方法进行了研究,采用的还原剂有NaBH4,KBH4,KBH4复合还原剂,金属钠,BER树脂,铜铬氧化物,骨架镍等。NaBH4的还原效果优于KBH4。考察了NaBH4还原L-丙氨酸乙酯的影响因素,优化最佳工艺条件为n(NaBH4): n(L-丙氨酸乙酯)投料比2:1,用水作溶剂,室温下反应4h,收率为84.7%。添加ZnCl2,AlCl3和LiCl能提高KBH4还原活性,其中ZnCl2的效果较好,收率可达60.2%。

酯交换反应条件对聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)力学性能的影响

以辛酸亚锡催化L-丙交酯(L-LA)和ε-己内酯(ε-CL)通过酯交换反应完成本体开环聚合制得可降解的生物医用材料聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)(PLLCA),其结构和热性能经1H NMR,高效凝胶色谱和差示扫描量热分析表征。研究了酯交换反应条件对PLLCA力学性能的影响,结果表明,提高聚合温度有利于酯交换反应进行,L-LA和ε-CL的平均嵌段长度减小,PLLCA的玻璃化转变温度(Tg)和拉伸强度也随之减小,断裂伸长率则单调增大;增大ε-CL的投料摩尔分数同样有利于酯交换反应的进行,L-LA的平均嵌段长度随之减小而ε-CL的平均嵌段长度则增大,Tg和拉伸强度均随之减小。

氨基酰化酶固定化细胞光学拆分DL-丙氨酸

用具有氨基酰化酶基因的大肠杆菌工程菌构建固定化细胞,并对DL-丙氨酸进行酶拆分进行了实验研究。考察了温度、pH、底物浓度、金属离子和时间对酶促反应的影响。确定了氨基酰化酶固定化细胞光学拆分DL-丙氨酸中酶促反应的最佳工艺条件:pH=7.5,温度50℃,反应时间6h,Co2+离子浓度5×10-4mol/L,在该条件下,D-丙氨酸产率为87.2%,光学纯度为98.0%。

聚(L-丙交酯)/聚(DL-丙交酯)的结晶性能及相溶性

用共溶液沉淀法制备了聚 (L 丙交酯 ) 聚 (DL 丙交酯 )共混物 (PLLA PDLLA) ,然后用成纤模压法压制成3 2mm的棒材 .用差示扫描量热法研究了共混物的结晶性能和相溶性 .结果表明 ,PLLA组分在共溶液沉淀过程中可生成结晶 ,共混物中PDLLA含量直到 30 %时 ,PLLA组分的结晶熔融温度和结晶度与纯PLLA相同 ,但PDLLA含量为 5 0 %时 ,PLLA组分的结晶熔融温度和结晶度明显下降 .由于加工成型条件的不一致性 ,共混物棒材中的PLLA组分的结晶熔融温度和结晶度呈较大的分散性 .共混物从熔体降温 ,在其后的升温DSC扫描中出现分别相应于PDLLA和PLLA的玻璃化转变 。

聚(L-丙交酯-co-乙交酯)的制备及性能研究

以辛酸亚锡为催化剂、1,4-丁二醇为引发剂,在高温、高真空条件下本体开环聚合制备了乙交酯与L-丙交酯质量比例为6∶4的聚(L-丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)。通过IR、1H NMR对聚合物的结构进行了表征,用DSC、TGA、XRD、流变仪等对聚合物的热性能、结晶性、流变性能进行了研究。研究结果表明PLGA具有较高的热稳定性,且是以非晶态存在的;其熔融流体为剪切变稀流体,储能模量较低,损耗模量较高。

D,L-丙交酯的聚合

为获得较高分子量的聚 D,L-丙交酯 ,以利于进一步的工业加工与生产 ,采用在低减压度下制得的 D,L-丙交酯经重结晶提纯至熔点为 12 5～ 12 6℃后 ,于 15 0～ 190℃下、3～ 7h内进行聚合 ,可得到聚 D,L -丙交酯粘均分子量 MV 最高为 1.43× 10 5 。

L-丙氨酸螯合铜(Ⅱ)的合成研究及表征

以L-丙氨酸、新制氢氧化铜粉末为原料,合成了L-丙氨酸螯合铜。运用正交实验法获得了最佳反应条件,L-丙氨酸和氢氧化铜物质的量之比为2∶1的混合物在75℃下,pH=6.0的环境中,反应3 h可以得到产率为69.3%的产物。并用EDTA滴定法测定络合物中铜元素的含量,用化学分析和红外光谱分析对其进行结构确认。

L-丙氨酸-N-羧基-环内酸酐的合成及其聚合研究

丙氨酸的四氢呋喃悬浮液在0℃下缓慢通入过量的干燥光气后升温至30℃合成得到了L 丙氨酸 N 羧基 环内酸酐(L Ala NCAn),研究了L Ala NCAn的开环聚合反应以及反应过程中溶剂、温度、引发剂及用量对聚合物特性黏度的影响。利用红外光谱确认了所得单体和聚合产物。用硝基苯作溶剂,三乙胺作引发剂,所得聚合物特性黏度为[η]=0 83dL/g。考虑到强酸对生物高分子的降解作用,实验中测定了二氯乙酸(DCA)对聚合物特性黏度的影响,结果发现二氯乙酸对聚丙氨酸特性黏度无影响。

L-丙交酯和聚L-乳酸的制备与性能

从左旋 L-乳酸经高温催化反应得到低聚 L-乳酸 ,再经高温裂解减压蒸馏制得单体 L-丙交酯( LL A) ,理论收率高达 80 %以上。LL A经纯化 ,再以辛酸亚锡为催化剂开环聚合得到聚 L-丙交酯 (聚 L-乳酸 ,PLLA) ,其粘均分子量可达到 4 0万。

光活环二肽环(L-脯-L-丙)和环(L-脯-L-缬)的合成

以L-脯氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸为原料,先用苄氧羰基保护L-脯氨酸的N端,再与C端保护的L-丙氨酸甲酯/L-缬氨酸甲酯缩合,得直链肽,再经Pd/C催化氢化脱保护基,以仲丁醇为溶剂回流关环,得到光活纯的环二肽(L-脯-L-丙)/环(L-脯-L-缬)。该方法耗时短、产率较高、不发生消旋,是一种通用的光活含脯氨酸环二肽的合成方法。

基于传统催化剂作用下L-丙交酯的合成分析

L 丙交酯是制备高的相对分子质量聚左旋乳酸PLLA的重要原料,其纯度和成本的高低决定了高的相对分子质量PLLA的质量和价格.以L 乳酸水溶液为原料,采用SnCl2或Zn为催化剂,经齐聚及解聚两步反应合成了L 丙交酯,光学纯度可达99%.研究了齐聚物相对分子质量、催化剂用量、齐聚反应温度、时间及解聚温度等因素与丙交酯收率及纯度的关系,选定合成的最佳条件为:采用SnCl2为催化剂,用量0.5%,脱水8h,齐聚温度和解聚温度分别低于170℃和220℃,所得丙交酯收率最高达93.2%.