强化厌氧表达dld基因以提高大肠杆菌工程菌发酵产L-乳酸的光学纯度

为去除廉价发酵原料中的D-乳酸从而提高发酵最终产物L-乳酸的光学纯度,该研究通过构建带有不同厌氧诱导启动子(pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB)的D-乳酸脱氢酶基因(dld)的表达质粒,并将其分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)HBUT-L,加强其在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。通过装液量与转速的单因素试验筛选最优的质粒表达条件及菌株,并在无机盐培养基与玉米浆培养基中进行发酵验证。结果表明,在装液量为200 mL/250 mL、转速为150 r/min的条件下,含有启动子pflBp6-pnirB的表达质粒的工程菌株HBUT-L4发酵18 h时D-乳酸脱氢酶活力最高,为81.1 U/g。在此条件下进行无机盐培养基和玉米浆培养基发酵时,工程菌株HBUT-L4相对于出发菌株HBUT-L,D-乳酸消耗速率分别提高250%、217%,L-乳酸的光学纯度分别从96.32%、98.48%提升至99.95%、99.98%。在大肠杆菌工程菌发酵L-乳酸的过程中,带有厌氧诱导启动子pflBp6-pnirB的表达质粒可提高D-乳酸脱氢酶活力,强化菌株消除外源D-乳酸,进而提高L-乳酸的光学纯度的能力,具有重要的工业化应用价值。

构建大肠杆菌合成生物群落利用混合糖同步发酵生产L-乳酸

目的:实现大肠杆菌混合糖发酵产L-乳酸过程中对葡萄糖-木糖的同步利用。方法:以L-乳酸工程菌大肠杆菌JH16(E.coli B,△frdBC△pflB△ackA△adhE,ldhA::ldhL)为出发菌株,通过RED同源重组技术敲除木糖转运及代谢基因xylFGH、xylE和xylA,获得不能利用木糖的菌株大肠杆菌JH16031。以大肠杆菌JH2705(E.coli JH16,△ptsG△mglB)为出发菌株,敲除葡萄糖转运及代谢基因crr、malX和galP,获得不能利用葡萄糖的菌株大肠杆菌JH27071,以构建大肠杆菌合成生物群落。通过摇瓶和5 L发酵罐试验确定该合成生物群落在混合糖发酵时较优的混合接种比例。结果:以60 g/L葡萄糖和40 g/L木糖为碳源进行发酵,当JH16031与JH27071初始接种比为1∶50,初始OD_(600nm)=0.5,混合糖的利用率最高,在84 h内消耗97%的糖,并在96 h内结束发酵。葡萄糖消耗速率为705 mg/(L·h),木糖消耗速率为435 mg/(L·h),L-乳酸产率为951 mg/(L·h),L-乳酸产量达到92 g/L,糖酸转化率为91%。结论:构建大肠杆菌合成生物群落可实现利用混合糖发酵产L-乳酸过程中葡萄糖和木糖的同步利用。研究结果为工业发酵生产中,使用低成本的木质纤维素为原料,降低发酵成本,提高混合糖利用率提供技术支持。

炔雌醇月缓释Poloxamer188复合聚L-乳酸电纺纤维的表征

目的考察在聚L-乳酸电纺纤维体系下,Poloxamer188复合量和炔雌醇的载药量对药物包裹和释放行为的影响。方法将炔雌醇、Poloxamer188、聚L-乳酸共同溶解在二氯甲烷中形成均相溶液后静电纺丝,其中Poloxamer188的复合量为聚L-乳酸质量的220%、240%、260%、280%、300%,炔雌醇的载量设为聚L-乳酸质量的5%、10%、15%。扫描电子显微镜观察纤维形态,差示热分析和X-射线衍射考察材料复合状态,高效液相色谱-紫外分光光度法测定释放介质中炔雌醇的含量,绘制释放曲线并拟合。结果所得产品均为微米级直径均匀无珠子结构的纤维。炔雌醇在纤维中复合良好,Poloxamer188在纤维表面有单体存在。炔雌醇在释放全程均为被增溶状态。随着Poloxamer188复合量的增高,药物释放量增加,随着炔雌醇载量的增高,药物释放量减少。Poloxamer188复合量为300%、炔雌醇载量为5%时,药物的百分释放量接近80%,缓释期可达28 d。释放曲线能够被Peppas方程式拟合。结论Poloxamer188复合量为聚L-乳酸的220%~300%时能够得到百分释放量较高的月缓释载炔雌醇电纺纤维。

利用竹基纤维素为碳源生物转化L-乳酸的潜力研究

以竹材制浆厂备料工段产生的废弃竹屑为原料,采用蒸汽爆破预处理且提取半纤维素后的竹基纤维素为碳源,同时对预处理前后竹屑采用扫描电子显微镜&能谱仪和激光粒度分析仪进行表征;用分步水解发酵工艺,结合高效液相色谱对发酵L-乳酸工艺关键参数进行了分析,探究了该碳源生物转化L-乳酸的潜力。结果表明,蒸汽爆破预处理提高了原料酶解还原糖释放量,在总固体(total solids,TS)质量浓度140 g/L、酶添加量60 FPU/g、酶解54 h条件下糖化,总糖质量浓度可达31.19 g/L。将糖化液用于发酵试验,在起始糖质量浓度19.43 g/L,发酵初始pH 6.5、菌株接种量5%、发酵17 h条件下,L-乳酸质量浓度可达6.28 g/L,其糖酸转化率高达80.87%。综上,该实验为竹基纤维素的利用提供了高值化途径参考。

抗菌性聚(L-乳酸)/单宁酸接枝薄膜的制备

分别合成聚(衣康酸-co-丁二醇)(PBI)和低分子量聚(L-乳酸)(OLLA),将两者混合后进行缩聚反应,得到聚(L-乳酸-co-衣康酸-co-丁二醇)(PLBI)。然后,采用单宁酸(TA)与甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)进行开环反应,制备了带有双键的光敏单宁酸(pTA)。最后,采用紫外光照表面接枝法制备了一系列抗菌性PLBI-pTA薄膜,对其化学结构、热学性能、力学性能、亲水性、疏水性及抗菌性能进行测试。结果表明,接枝pTA后,薄膜玻璃化转变温度及结晶度均降低,薄膜的断裂伸长率升高,最高可达328.1%,使PLBI-pTA薄膜具有较好的延展性。薄膜的水接触角由72.20°减小至30.47°,薄膜表面的亲水性得到提高。另外,随着pTA含量的增加,薄膜对大肠杆菌的杀菌率逐渐提升,最高可达86%。

L-乳酸合成L-丙交酯过程中的定量问题及其提高选择性的方法

聚乳酸(PLA)是一种很有前途的可降解、可再生和生物相容性的聚合物,L-丙交酯作为生产聚乳酸的重要中间体,其纯度直接影响聚乳酸的质量和生产成本。丙交酯通常采用气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)或核磁共振氢谱法(^(1)H NMR)定量。然而,发现GC在乳酸生产丙交酯的过程中并不适用于定量,丙交酯收率总是比LC高得多。详细的分析表明,一些在反应过程中没有完全转化的乳酸低聚物在高温下可以发生解聚生成丙交酯,从而使丙交酯的产率比实际的高。因此,LC是一种较为准确的丙交酯定量分析方法。基于这一现象,采用固定床反应器模拟GC分析的反应条件,大大提高了丙交酯的选择性和收率。优化后的反应条件可使丙交酯的最高收率达到100%。

耐酒精高产L-乳酸菌株的筛选及发酵培养基优化

为提高L-乳酸产量,降低L-乳酸的生产成本,该研究经过筛选、驯化获得一株耐酒精且高产L-乳酸的菌株鼠李糖乳杆菌AK-0779。使用玉米酒糟代替部分酵母粉作为菌株AK-0779发酵培养基的氮源。在单因素实验基础上,对葡萄糖添加量、酵母粉添加量和玉米酒糟添加量进行三因素三水平响应面优化试验。结果表明,最适发酵培养基为:葡萄糖添加量9.80%,玉米酒糟添加量0.98%,酵母粉添加量1.72%,L-乳酸产量为78.91 g/L,糖酸转换率为80.52%。与酵母粉完全充当氮源产L-乳酸82.36 g/L相比,产量无显著差异,说明玉米酒糟能有效代替部分酵母粉作为发酵培养基的氮源,降低L-乳酸生产成本。

鼠李糖乳杆菌L-乳酸脱氢酶的生物信息学分析和基因克隆

本研究以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)L-乳酸脱氢酶(Lr-L-LDH)为研究对象,以研究较多的Lr-L-LDH1为对照,对基因组注释的两个Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2基因,进行异同分析。采用在线网站和专业软件对Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2的一级结构、基本特性、亲疏水性、二级结构进行分析和预测,对三级结构进行同源建模以及酶和底物的分子对接分析,并对酶的编码基因进行系统发育分析,克隆表达及酶活性检测。结果显示:相较于Lr-L-LDH1,Lr-L-LDH2有着相似的分子特性,二级和三级结构,但Lr-L-LDH2编码序列短,氨基酸序列同源性低(48.08%),有不同的进化地位;Lr-L-LDH2也含有乳酸脱氢酶催化活性位点序列和保守的NAD^(+)结合位点序列(GXGXXG),能够形成典型的活性三维口袋域,是NAD^(+)依赖型四聚体结构L-乳酸脱氢酶,在细胞中需要果糖1,6-二磷酸(FBP)来激活,催化丙酮酸还原为L-乳酸;体外克隆表达和酶学分析表明,Lr-L-LDH2酶活力极显著低于Lr-L-LDH1(P<0.01)。Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2都具有乳酸脱氢酶活性,推测二者在乳酸表达调控中相互作用,对鼠李糖乳杆菌L-乳酸脱氢酶的分子改造应同时考虑Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2的作用,研究对乳酸发酵工业的基因工程改造提供分子基础和科学依据。

L-乳酸促进皮下脂肪细胞棕脂分化和产热

文章为模拟适度运动后的乳酸水平,用5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸钠处理原代培养的皮下脂肪基质血管组分细胞和分化后的棕色脂肪细胞,检测产热基因、UCP1蛋白和AMPK磷酸化蛋白表达水平,结果表明,L-乳酸处理促进了皮下脂肪细胞分化过程中和分化成熟后产热基因和UCP1蛋白的表达。AMPK信号参与了L-乳酸促进棕脂细胞产热的进程。研究结果为乳酸改善机体代谢提供新的理论依据,并为肥胖及其相关的代谢性疾病提供了一种新的预防和治疗手段。

线形聚(D,L-乳酸)和星形聚(D,L-乳酸)的合成研究

在辛酸亚锡Sn(Oct)_(2)催化下,分别用丙炔醇和季戊四醇引发D,L-丙交酯(DLLA)的开环聚合(ROP),合成了具有末端炔基的线形聚(D,L-乳酸)(PDLLA)和四臂星形聚(D,L-乳酸)(S-(PDLLA)4),通过核磁共振氢谱(^(1)H NMR)和凝胶渗透色谱(GPC)对聚合物的结构和相对分子质量进行了表征。合成产物可用于后续制备基于聚乳酸的两亲性嵌段共聚物,为生物可降解性高分子材料的开发应用提供实验依据。

厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

【目的】为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题。【方法】构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5和HBUT-D7。通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵。【结果】HBUT-D7的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株。以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率分别为10.41 mg/(L·h)及34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为4.24 g/(L·h)及3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.07%及99.92%。以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为1.93 g/(L·h)及1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.22%及99.99%。【结论】厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度。

L-乳酸修饰自具微孔聚合物膜的制备及应用

用L-乳酸与5,5’,6,6’-四羟基-3,3,3’,3’-四甲基-1,1’-螺旋双茚满、四氟对苯二腈共同反应生成L-乳酸修饰自具微孔聚合物,并将其制备成膜。探究L-乳酸修饰自具微孔聚合物膜对酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸对映体的手性选择性渗透行为,并与未修饰自具微孔聚合物膜进行对比。实验结果表明,未修饰自具微孔聚合物膜不能手性选择性渗透酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸对映体;而L-乳酸修饰自具微孔聚合物膜可以手性选择性渗透酪氨酸对映体。最后,采用对接模拟方法对L-乳酸修饰自具微孔聚合物与色氨酸对映体的相互作用进行研究。

乳酸抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的研究

目的探究乳酸对心肌成纤维细胞的纤维化表型的调节作用和可能机制。方法小鼠心肌成纤维细胞分为对照组(常规培养)、低剂量实验组(4 mmol·L^(-1)L-乳酸)、中剂量实验组(8 mmol·L^(-1)L-乳酸)、高剂量实验组(12 mmol·L^(-1)L-乳酸)、转化生长因子-β1(TGF-β1)组(10 ng·mL^(-1)TGF-β1)、联合组(10 ng·mL^(-1)TGF-β1+12 mmol·L^(-1)L-乳酸)和乳酸转运蛋白抑制药(CHC)组(3 mmol·L^(-1)CHC)。用蛋白质印迹法检测纤维化相关蛋白的表达水平以及泛乳酸化修饰(Pan Kla)和H3组蛋白K18位乳酸化修饰情况,用细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。结果对照组、TGF-β1组、高剂量实验组和联合组的细胞迁移率分别为(40.56±0.03)%、(61.61±0.04)%、(26.59±0.05)%和(38.33±0.06)%,TGF-β1组、高剂量实验组的细胞迁移率和对照组相比较,TGF-β1组的细胞迁移率和联合组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01)。对照组、TGF-β1组、高剂量实验组、联合组的Ⅰ型胶原A1(COL1A1)蛋白相对表达水平分别为0.76±0.09、1.10±0.07、0.40±0.04和0.68±0.10,COL3A1蛋白相对表达水平分别为0.87±0.05、1.15±0.07、0.32±0.07和0.73±0.06,α-平滑肌肌动(α-SMA)蛋白相对表达水平分别为0.86±0.04、1.24±0.09、0.30±0.05和0.74±0.08,TGF-β1组、高剂量实验组的上述指标和对照组比较,TGF-β1组的上述指标和联合组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01)。对照组、高剂量实验组和CHC组小鼠心肌成纤维细胞的细胞迁移率分别为(62.60±6.50)%、(28.00±8.15)%和(39.40±4.50)%,COL1A1蛋白相对表达水平分别为1.10±0.07、0.49±0.04和0.34±0.06,COL3A1蛋白相对表达水平分别为1.04±0.10、0.60±0.20和0.37±0.03,α-SMA蛋白相对表达水平分别为1.20±0.11、0.67±0.20和0.48±0.18,Pan Kla蛋白修饰水平分别为1.06±0.07、1.54±0.09和1.53±0.12,H3K18la蛋白修饰水平分别为0.67±0.06、1.23±0.06和1.14±0.08,CHC组和高剂量实验组的上述指标与对照组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论L-乳酸可能通过增加非组蛋白乳酸化修饰和H3K18la修饰来发挥抑制小鼠心肌成纤维细胞纤维化表型的作用。

白酒酿造中两种手性乳酸产生机理及控制措施的研究进展

白酒酿造中,开放式发酵将乳酸菌引入酒醅产生L-乳酸和D-乳酸,乳酸通过蒸馏进入酒体,是白酒中重要的风味物质,但过多乳酸有可能影响酒精代谢以及饮用舒适度。酿造原料、乳酸菌菌种和酿造工艺的不同导致白酒中两种手性乳酸含量和比例不同,从而导致白酒的风味和品质差异。该文综述了白酒酿造中两种手性乳酸的产生机理,总结了其在人体中的代谢作用,简述了白酒中两种手性乳酸的含量及比例差异,探讨了酿造原料、酒曲、酒醅、发酵进程、发酵温度、L-乳酸高产菌选育、蒸馏工艺和窖泥对两种手性乳酸产生的影响及控制措施,以及两种手性乳酸对白酒品质的影响,旨在不影响白酒风味的前提下为生产中增加L-乳酸和降低D-乳酸的调控提供一些参考。

L-丙交酯和聚L-乳酸的制备与性能

从左旋 L-乳酸经高温催化反应得到低聚 L-乳酸 ,再经高温裂解减压蒸馏制得单体 L-丙交酯( LL A) ,理论收率高达 80 %以上。LL A经纯化 ,再以辛酸亚锡为催化剂开环聚合得到聚 L-丙交酯 (聚 L-乳酸 ,PLLA) ,其粘均分子量可达到 4 0万。

L-乳酸和聚乳酸的研究进展

综述了乳酸发酵和提取工艺以及聚乳酸的合成进展,分析了L-乳酸及合成聚乳酸两种产品的市场前景,对进一步的技术开发提出了建议。

乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

与其它微生物相比,用大肠杆菌进行发酵生产乳酸有许多优势,但大肠杆菌没有L乳酸脱氢酶基因,不能利用糖发酵生产L乳酸.本文采用PCR技术,以乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)基因组DNA为模板,克隆得到L乳酸脱氢酶(Llactatedehydrogenase)基因,将该基因的ORF连接到表达质粒pET22b(+),获得重组质粒pETldhL.将pETldhL质粒转化大肠杆菌BL21株,实现了ldhL基因的表达;对含有ldhL基因的重组菌株进行表达研究,在30℃以IPTG诱导8h后,SDSPAGE分析可见明显特异性条带,酶活力达到6.49u/mL,是野生菌酶活力(2.82u/mL)的2.3倍.对重组表达的L乳酸脱氢酶生物学特性研究显示,它们的最适反应温度为27～30℃,最适反应pH为5.0～5.3.

双极膜电渗析分离发酵液中L-乳酸

采用三室型双极膜电渗析装置将发酵液中的L-乳酸钠转化为L-乳酸。探讨操作电压、流速、进料L-乳酸钠质量浓度等工艺参数对转化过程的影响,考察电渗析过程参数对转化率、物料损失率、电流效率和能耗等技术指标的影响。在最优操作条件下(流速40 L/h,电压15 V)对2 L的100.25 g/L乳酸钠发酵液进行分批重复电渗析处理。结果表明:整个过程的转化率为81.22%,损失率为1.5%,能耗为0.81 kW.h/kg,电流效率为91.8%,得到的L-乳酸质量浓度可达144.31 g/L。电渗析残液补糖后可回到发酵罐中用于发酵生产L-乳酸。

高效液相色谱法对泡菜中L-乳酸和D-乳酸的手性分离和测定

采用高效液相法和手性分离柱对泡菜发酵上清液中的L-乳酸和D-乳酸进行分离和测定。泡菜的培养上清液用8000r/min离心20min,再用0.45μm滤膜过滤。滤液用配备二极管阵列检测器的高效液相系统检测,检测波长为254nm。检测色谱柱为手性柱Chirex3126(D)-penicillami(4.6mmi.d×250mmL,5μm),流动相为2mmol/LCuSO4溶液(溶剂为5%的异丙醇溶液)。L-乳酸和D-乳酸的标准曲线在2.5-20.0g/L范围线性良好,两者的线性相关系数都为0.999。泡菜滤液的L-乳酸和D-乳酸的回收率分别是99.82%和100.02%。该方法操作简便,精密度和准确度高,适用于泡菜中L-乳酸和D-乳酸的测定。

根霉发酵L-乳酸

本文报道了选育一株产L-乳酸的根霉JSMI-R73,对该菌的性能及影响产酸的条件进行了研究,并进行了500升罐的扩大试验。当口服葡萄糖浓度为10％时产酸70g/l以上,13％时产酸101g/l,其中L-乳酸稳定在85％以上,最高达98％。该菌能适应玉米作培养基,当玉米浓度为12％时产酸70g/l以上,20％时产酸105g/l以上,其中L-乳酸在88％以上,最高可达99％,达到了与葡萄糖相似的发酵水平,这是较有实用意义的结果。