L-^(15)N亮氨酸和质谱测定大鼠肝蛋白质合成

目的:建立稳定同位素L 15N亮氨酸测定大鼠肝蛋白质合成率的方法。 方法:分别测定静脉注射相同剂量L 15N亮氨酸不同时相的大鼠肝15N丰度及不同剂量L 15N亮氨酸同一时相的大鼠肝15N丰度。 结果:大鼠肝游离氨基酸池中15N同位素丰度在注射后30min内呈线性上升并达高峰,维持4h后缓慢下降,肝蛋白质中的15N丰度30min至12h基本维持不变;随着注射剂量的增加,大鼠肝蛋白质分数合成率亦增加,当L 15N亮氨酸剂量>1. 0mmol/kg,分数合成率并不随施加L 15N亮氨酸剂量的加大而增加。 结论:在进行大鼠肝蛋白质合成率测定时,一次性静脉注射的测量最佳时限为30min,剂量为1. 0mmol/kg。

应用L-^(15)N亮氨酸测定大鼠骨骼肌蛋白质合成

目的:建立稳定同位素L1-5N亮氨酸测定大鼠骨骼肌蛋白质合成率的方法。方法:分别测定静脉注射相同剂量L1-5N亮氨酸不同时相的大鼠骨骼肌15N丰度及不同剂量L1-5N亮氨酸同一时相的大鼠骨骼肌15N丰度。结果:大鼠骨骼肌游离氨基酸池中15N同位素丰度在注射后30 m in内呈线性上升并达高峰,维持4 h后缓慢下降,骨骼肌蛋白质中的15N丰度30 m in至12 h基本维持不变;随着注射剂量的增加,大鼠骨骼肌蛋白质分数合成率亦增加,当L1-5N亮氨酸剂量>1.0 mmol/kg,分数合成率并不随施加L1-5N亮氨酸剂量的加大而增加。结论:在进行大鼠骨骼肌蛋白质合成率测定时,一次性静脉注射的测量最佳时限为30 m in,剂量为1.0 mmol/kg。

^(15)N标记L-亮氨酸

采用生物发酵法制备15N标记的L-亮氨酸。以实验室选育获得的突变株黄色短杆菌TLU53-8为出发菌株,研究适用于15N标记L-亮氨酸生产的实验配方、发酵工艺、提纯工艺。结果表明,菌株发酵产酸量>18 g/L。产品中15N同位素丰度>98%,15N纯度>99%。此工艺适用于制备高品质15N标记L-亮氨酸,具有较高的经济价值。

^(15)N标记L-胱氨酸

以15NH4Cl为起始原料,通过改进的Gabriel方法得到S-苄基-D,L-半胱氨酸,再经酶法拆分和解保护后得到15N标记L-胱氨酸。对影响各步反应收率的主要因素进行了考察,在较优的工艺条件下,以15NH4Cl计,15N标记L-胱氨酸收率为13.5%,产物经HPLC、红外、质谱和元素分析等证实,质谱分析表明未出现同位素丰度稀释现象。

微生物发酵法批量制备高丰度^(15)N同位素标记L-精氨酸

采用均匀设计实验方法建立5L罐发酵生产L-精氨酸-^(15)N_4的优化调控模型。在菌体生长24h进入产酸阶段,控制转速820r/min,pH7.8,温度30℃,通气2.5L/min,流加总量60%的葡萄糖,理论产酸最高可达到22.49g/L,验证实验产酸19.69g/L,达到理论高值的88%。利用^(15)N丰度99.68%的尿素和丰度99.43%的硫酸铵发酵生产得到L-精氨酸-^(15)N_4的产品丰度为98.7%,化学纯度为98.5%,丰度下降<1%。可以满足批量生产的要求。

酵母合成的^(15)NL-色氨酸中N元素代谢通量的分析

以葡萄糖为碳源,硫酸铵为氮源,15N邻氨基苯甲酸为前体物,利用酵母发酵合成15N L-色氨酸,是合成15NL-色氨酸的一种新方法。为了有效的利用含氮的化合物,实验过程中,采用15N标记的邻氨基苯甲酸为示踪剂,分析了N元素在15N L-色氨酸合成过程中的代谢通量。结果表明,93%外加的邻氨基苯甲酸被转化为15N L-色氨酸。硫酸铵在促进菌体生长的同时,0.05%硫酸铵被用于合成邻氨基苯甲酸,并进一步被转化为L-色氨酸,5.95%硫酸铵被直接用于合成15N L-色氨酸。

发酵优化制备L-赖氨酸盐酸盐-13C6、15N2

采用北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)ZLD118(HS-、AECr)发酵制备稳定同位素双标记的L-赖氨酸盐酸盐-13C6、15N2。对菌种的发酵培养条件和发酵培养基配方进行优化,采用优化后的发酵工艺制备高丰度稳定同位素13C、15N双标记L-赖氨酸,经离子交换树脂提纯、活性炭脱色精制后,产品的13C丰度达98.61%,15N丰度为98.15%,纯度为98.47%,产率为88.8%。结果表明,该工艺可进一步用于放大制备。

喷施外源氨基酸对水稻干重及含氮量的影响

为了探索外源氨基酸对水稻干重及含氮量的影响,本试验采用500mg·L^(-1)L-亮氨酸-^(15)N在分蘖期、抽穗期、蜡熟期喷施水稻叶面,并以清水为对照。结果表明,喷施外源L-亮氨酸-^(15)N处理组中的叶、茎鞘、稻谷的干重及含氮量均显著高于对照组,分蘖期、抽穗期、蜡熟期3个时期喷施L-亮氨酸-^(15)N比分蘖期、抽穗期2个时期喷施其干重及含氮量高,分蘖期、抽穗期2个时期喷施L-亮氨酸-^(15)N比只喷施分蘖期其干重及含氮量高,叶面吸收^(15)N约50%运输到水稻的籽粒。本研究对提高稻米产量及品质具有重要的实际生产意义。

水稻对外源氨基酸的吸收与转运

采用不同浓度的L-蛋氨酸培养液培养秧苗,并用L-亮氨酸15N喷施分蘖期、抽穗期和蜡熟期水稻叶面,研究水稻根系对L-蛋氨酸、水稻叶面对L-亮氨酸15N吸收情况。结果表明,用1 000、2 000、3 000、4 000 mg/L的L-蛋氨酸溶液浸根培养,与对照相比,秧苗L-蛋氨酸含量分别增加8.2%,9.8%、19.7%、21.3%;用500 mg/L的L-亮氨酸15N在分蘖期、抽穗期和蜡熟期喷施水稻叶面,三个时期都会不同程度吸收L-亮氨酸,吸收最好的时期是抽穗期和蜡熟期。

肿瘤坏死因子对谷氨酰胺调控大鼠骨骼肌蛋白质合成的影响

目的:研究促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)对谷氨酰胺(G ln)调控大鼠骨骼肌蛋白质合成的影响。方法:雄性SD大鼠30只,随机分为三组:完全肠道外营养(TPN)组,TPN+G ln组和TPN+G ln+TNF-α组。每组各10只大鼠,三组大鼠均行72 h TPN。TPN+G ln组加用丙氨酰谷氨酰胺二肽,提供的G ln剂量为0.3g/(kg.d),共72 h。TPN+G ln+TNF-α组在实验结束前24 h持续静脉滴注TNF-α,速度为5μg/(kg.h),并加入丙氨酰谷氨酰胺二肽(用法同TPN+G ln组)。三组所供营养液氮(N)量、热量均等。所有大鼠均在取材前30 m in一次性静脉注射[L1-5N]亮氨酸,剂量为1.0mmol/kg。分别测定血浆中TNF-α浓度、血浆及组织中G ln浓度,并测定骨骼肌组织的蛋白质合成率。结果:血浆及骨骼肌组织中G ln浓度,TPN组低于TPN+G ln组,两组均低于TPN+G ln+TNF-α组;骨骼肌蛋白质合成率TPN组最低,TPN+G ln组最高。以上各组之间差异均具有显著性意义(P<0.01)。结论:TNF可升高血浆及骨骼肌组织中G ln的浓度;G ln能促进骨骼肌蛋白质合成;而G ln这种促骨骼肌蛋白质合成作用可被TNF-α抑制。

肿瘤坏死因子对谷氨酰胺调控大鼠肝蛋白质合成的影响

目的:研究肿瘤坏死因子(TNFα-)对谷氨酰胺(G ln)调控大鼠肝蛋白质合成的影响。方法:将30只雄性SD大鼠,随机分为A(TPN)组;B(TPN+G ln)组;C(TPN+G ln+TNFα-)组,均行72 h全肠外营养。B组加用丙氨酰谷氨酰胺二肽,其中G ln剂量为0.3 g/(kg.d),计72 h。C组在B组的基础上于实验结束前24 h持续静脉滴注TNFα-,速度为5μg/(kg.h)。所有大鼠均在实验结束前0.5 h,一次性静脉注射L-15N亮氨酸1.0 mmol/kg。实验结束时,分别测定血浆中TNFα-浓度,血浆及组织中G ln浓度,并测定肝组织的蛋白质合成率。结果:B组血浆及肝组织中G ln浓度高于A组,但两组均低于C组;B组肝蛋白质合成率高于A组,C组低于B组。结论:TNFα-能升高血浆及肝组织中G ln的浓度;G ln能促进肝蛋白质合成;而G ln这种促肝蛋白质合成作用可被TNFα-抑制。

安普霉素的生物合成:辛二糖C7′-N上甲基的甘氨酸来源

安普霉素是一类结构特殊的氨基糖苷类抗生素,其分子中含一个稀有的辛二糖结构单元.迄今为止,尚无关于安普霉素生物合成途径及其前体化合物的完整报道.研究发现,向发酵培养基中添加甘氨酸和丝氨酸均可以出现在菌体生长保持基本不变的情况下促进抗生素产量的现象,表明甘氨酸和/或丝氨酸可能参与了安普霉素的合成.[2-13C]甘氨酸示踪实验的核磁共振(NMR)检测结果表明,甘氨酸专一地掺入安普霉素辛二糖环C7′-N甲基.同时发现,菌体胞内的S腺苷甲硫氨酸(SAM)水平上升与外加甘氨酸的量呈正比,但是甲硫氨酸的加入会抑制安普霉素的合成.据报道,甲硫氨酸对结构中含有甲基取代基的抗生素,如对rapamycin的生物合成中转甲基过程有抑制作用.由此推测,尽管甲硫氨酸本身对抗生素产量呈抑制作用,甘氨酸仍然可能通过甲硫氨酸循环提供甲基.此外,[2-13C,15N]丝氨酸的示踪实验结果表明丝氨酸也可能作为安普霉素的限制性前体物参与了NH2的合成.

稳定性核素测定大鼠小肠蛋白质合成

目的:建立稳定性核素([L1-5N]亮氨酸)测定大鼠小肠蛋白质合成率的方法。方法:分别测定静脉注射相同剂量[L1-5N]亮氨酸不同时相的大鼠小肠15N丰度及不同剂量[L1-5N]亮氨酸同一时相的大鼠小肠15N丰度。结果:大鼠小肠游离氨基酸池中15N核素丰度在注射后0.5 h内呈线性上升并达高峰,维持4 h后缓慢下降,小肠蛋白质中的15N丰度0.5 h至12 h基本维持不变;随着注射剂量的增加,大鼠小肠蛋白质分数合成率(FSR)亦增加,当[L1-5N]亮氨酸剂量在1.0mmol/kg以上,FSR并不随施加[L1-5N]亮氨酸剂量的加大而增加。结论:在进行大鼠小肠蛋白质合成率测定时,一次性静脉注射的测量最佳时限为0.5 h,剂量为1.0mmol/kg。

稳定性核素在测定大鼠组织蛋白质合成中的应用

目的:研究应用稳定性核素(L-15N亮氨酸)测定大鼠组织蛋白质合成率的方法。方法:分别测定静脉注射相同剂量L-15N亮氨酸不同时相的大鼠组织15N丰度及不同剂量L-15N亮氨酸的同一时相大鼠组织15N丰度。结果:大鼠组织中游离及结合氨基酸同位素丰度在注射后半小时内几乎呈线性上升并达高峰,游离氨基酸15N丰度维持4h后缓慢下降,结合氨基酸15N丰度在半小时至12h之内基本维持不变;随着注射剂量的增加,大鼠组织蛋白质分数合成率亦增加。当L-15N亮氨酸剂量>1.0mmol/kg,分数合成率并不随施加L-15NLeucine剂量的加大而增加。结论:在进行大鼠组织蛋白质合成率测定时,一次性静脉注射的测量最佳时限为半小时,剂量为1.0mmol/kg。