苹果果实L-半乳糖脱氢酶cDNA的克隆及其RNAi载体的构建

【目的】从"皇家嘎拉"苹果幼果外果皮中克隆L-半乳糖脱氢酶(L-galactose dehydrogenase,GalDH)cDNA,进行生物信息学分析并构建其RNAi植物表达载体,为该基因功能鉴定奠定基础。【方法】应用同源序列克隆法克隆"皇家嘎拉"苹果GalDH基因,并进行生物信息学分析;利用噬菌体同源重组原理构建其RNAi植物表达载体pMDR-GalDH,并导入农杆菌EHA105。【结果】通过RT-PCR扩增得到1条约1.1 kb的条带,序列分析表明,该片段长为1 111 bp,包含一个975 bp的开放阅读框,可编码324个氨基酸残基,包含有醛酮还原酶的保守结构域和3个跨膜螺旋结构,其理论上的等电点pI为5.44,蛋白分子质量为34.99 ku;聚类分析显示,苹果GalDH核苷酸与已知其他植物GalDH核苷酸的相似性均在95%以上,判断其为苹果GalDH基因cDNA全长,命名为MdGal DH(GenBank登录号为:GQ131419)。另外,通过RT-PCR获得GalDH基因保守区段,成功构建了其RNAi植物表达载体pMDR-GalDH。【结论】从"皇家嘎拉"苹果中克隆了GalDHcDNA的编码区全长,并构建了该基因的RNAi植物表达载体。

水稻L-半乳糖脱氢酶基因的克隆与序列分析

[目的]对水稻L-半乳糖脱氢酶(L-GalDH)基因进行克隆与序列分析。[方法]通过RT-PCR从水稻中克隆了L-GalDH基因,采用GenBank的BLAST程序进行序列分析。[结果]水稻L-GalDH基因的cDNA全长1 340 bp,包含一个长为951 bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与其他植物的L-半乳糖脱氢酶基因的同源性较高,其中与大麦的同源性最高,序列一致率为92%,与菠菜的序列同源性稍低,一致率为71%。系统进化分析结果表明不同来源的L-GalDH基因聚为3类。[结论]该研究为L-GalDH基因的功能研究打下了基础。

猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶和脱氢抗坏血酸还原酶cDNA片段的克隆与序列分析

克隆猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,可为揭示猕猴桃高抗坏血酸(AsA)含量的分子机制奠定基础。研究以猕猴桃果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出L-GalLDH基因的cDNA片段857 bp和DHAR基因的cDNA片段594 bp并测序,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因和DHAR基因氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,猕猴桃GalLDH基因氨基酸序列和核苷酸序列与刺梨的相似性高达88%,其在同源基因进化关系树中单独聚为一类;DHAR基因氨基酸序列和核苷酸序列与苹果的相似性高达98%和99%,两者在进化关系上聚为一类。可知克隆到的2个核苷酸片段确为猕猴桃L-GalLDH和DHAR基因cDNA片段,同源基因植物亲缘关系聚类与传统的形态分类有一定的差异。

水稻L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆和原核表达及抗体的制备

应用RT-PCR技术从水稻叶片中克隆了水稻L-半乳糖内酯脱氢酶(GLDH)的全长基因.序列分析表明,水稻GLDH基因全长1752bp,亚克隆其部分成熟蛋白编码基因(789bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET30a-GLDHe,经酶切鉴定,DNA测序,证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析证实表达出相对分子质量约为36000的蛋白.用原核表达蛋白作为抗原免疫家兔制备抗体,用Westernblot检测抗体的特异性及效价,结果表明,抗体血清效价为1∶1000,在加IPTG诱导后的菌液中可以检测到相应的蛋白条带((相对分子质量为36000)),在水稻叶片样品中能检测到1条相对分子质量为36000的蛋白条带.

毛花猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶基因cDNA片段的克隆与序列分析

毛花猕猴桃果实中Vc含量极高,为了揭示毛花猕猴桃Vc形成规律,根据已知植物的L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)基因,设计简并引物,以毛花猕猴桃新品种‘华特’果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出一条长661 bp的cDNA片段,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因编码的氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,所克隆片段编码氨基酸序列与美味猕猴桃GalLDH相似度高达99%,其在同源基因进化关系上聚为一类,与葡萄的GalLDH相似性高达91%,与草莓、刺梨、甘薯、温州蜜柑、拟南芥、甜瓜等植物的GalLDH同源性均在80%以上,可知克隆到的核苷酸片段确为毛花猕猴桃GalLDH基因的cDNA片段。

软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆及原核表达分析

为更好了解L-半乳糖内酯脱氢酶及编码基因在软枣猕猴桃中的生理功能及作用,以‘魁绿’软枣猕猴桃果实cDNA为模板,用RT-PCR及RACE技术,获得L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因AaGalLDH(GenBank:KP145007.1)。序列分析表明该基因全长为2394 bp,开放阅读框为1833 bp,编码610个氨基酸,与其它植物GalLDH氨基酸序列具有78%~95%的同源性。编码的蛋白序列具有GalLDH蛋白家族典型的保守结构域。进一步将该基因连接到原核表达载体并转化大肠杆菌进行诱导表达,经Western Blotting验证,目的基因在pET-28a表达系统中有表达,但基本为不溶性表达。这为进一步研究该酶蛋白的体外表达和功能以及选育高品质软枣猕猴桃品种奠定了基础。

枸杞L-半乳糖酸内酯脱氢酶基因的克隆及表达分析

以青海枸杞（Lycium barbarum L.）为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆枸杞L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（GLDH）基因序列,命名为LbGLDH。LbGLDH基因全长为2 114bp,包含一个开放读码框1 767bp（编码588个氨基酸）、5′末端序列57bp、3′末端序列290bp。LbGLDH基因核苷酸序列与番茄、马铃薯、烟草GLDH基因具有88%～90%的一致性。LbGLDH编码氨基酸序列包含GLDH蛋白酶具备的FAD-binding-4和ALO结构域。qRT-PCR分析结果显示,在枸杞不同组织中LbGLDH基因的表达、抗坏血酸含量和GLDH活性变化趋势相同,表现为在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少。推测LbGLDH基因表达促进枸杞果实中抗环血酸含量的积累。

黄瓜L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶cDNA全长的克隆和遗传转化

以黄瓜D08108果实为材料,根据GenBank中登录的甜瓜L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出黄瓜GalLDH的cDNA全长,GenBank登录号为HQ446099。黄瓜GalLDH的cDNA序列全长1 880 bp,包含一个长为1 773 bp的完整开放阅读框,编码590个氨基酸。其核苷酸序列与已知其他植物核苷酸序列间的同源性达70%以上。共检测得到5棵转基因植株。

柑橘L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因的克隆

利用同源序列法结合电子克隆技术,从温州蜜柑幼果中克隆到长度为2 111 bp的L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因(citGalLDH),GenBank登录号为FJ849840。生物信息分析表明该基因包含一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸,分子质量为68 628.63 u,等电点为8.727;柑橘GalLDH蛋白具备FAD_binding_4和ALO结构域,与杨树和拟南芥GalLDH蛋白的关系较近。所克隆的citGalLDH可为深入研究柑橘Vc合成分子机制奠定基础。

植物抗坏血酸合成的关键酶:L-半乳糖内酯脱氢酶(GLDH)

本文从酶的催化反应、酶学特征、分子生物学特性等方面介绍植物抗坏血酸合成的关键酶L-半乳糖内酯脱氢酶的研究进展。

沙棘维生素C积累与相关酶活性关系研究

探讨沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.)不同器官中抗坏血酸(As A)积累与相关代谢酶活性的关系。结果表明,As A在沙棘幼叶和果实中含量较高,在茎和花中含量较低。沙棘幼叶和果实中As A含量主要受L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(Gal LDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性调节,抗坏血酸氧化酶(AAO)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)对As A的积累也有调节作用。

不同叶龄菠菜叶片抗坏血酸含量与其代谢相关酶活性的比较

以欧丽特菠菜叶片为试材,研究了菠菜叶片发育过程中3个时期叶片(幼叶、成熟叶、衰老叶)的抗坏血酸代谢变化及抗坏血酸含量与其相关酶活性的关系。结果表明:抗坏血酸(AsA)和氧化型抗坏血酸(DHA)含量的变化趋势与L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)以及脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性的变化趋势基本一致,而与抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性变化呈此消彼长。同时单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)和还原型谷胱甘肽(GSH)有助于AsA的再生。说明通过增加GalLDH和再生酶活性能提高菠菜叶片AsA的含量,并延缓其衰老。

苹果果实GalDH和GalLDH基因的表达与AsA的关系

【目的】进一步探明苹果果实是否具有抗坏血酸(AsA)合成的能力。【方法】从‘嘎拉’苹果果实中克隆AsA合成关键酶L-半乳糖脱氢酶(L-galactose dehydrogenase,GalDH)全长cDNA序列,检测它与另一合成酶L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase,GalLDH)在苹果不同组织中的表达及酶活性与AsA含量的关系。【结果】克隆获得的苹果GalDH cDNA含有975bp的完整开放阅读框,编码一条分子量为34.97kD、含324个氨基酸残基的蛋白质,登录号为GQ131419。在叶片和苹果果实不同组织中,均能检测到GalDH和GalLDH基因mRNA表达和活性,叶片高于果实,幼果高于成熟果,果皮高于果肉。同时,苹果果皮中的AsA含量受光的调控,二者在阳面果皮的表达和活性明显高于阴面果皮,而阳、阴面果肉间无明显差异。不同组织中的AsA含量与GalDH和GalLDH活性均呈显著正相关性。【结论】进一步证明了苹果果实自身具有经L-半乳糖途径合成AsA的能力,且合成可能是苹果果实AsA形成的主要决定因子。

阔叶猕猴桃GalDH基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究

L-半乳糖脱氢酶(GalDH)是L-半乳糖途径合成抗坏血酸(ASA)的关键酶之一,为了研究GalDH基因的功能,获得转基因植株,用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ将已克隆的阔叶猕猴桃GalDH基因从克隆载体pMD-19T切下,定向插入到植物表达载体pCSB,成功构建阔叶猕猴桃GalDH基因植物表达载体pCSB-GalDH及工程农杆菌,以Micro-Tom番茄叶片及茎段为受体,通过农杆菌介导法转化番茄,PCR检测、GUS染色和Real-time PCR检测表明,阔叶猕猴桃GalDH基因已整合到番茄基因组中。

苹果叶片离体衰老过程中抗坏血酸代谢的变化

以苹果(M a lus d om estica Borkh)品种嘎拉(G a la)秋梢成熟叶片为试材,在水培养条件下,研究了离体苹果叶片衰老过程(0,6,12,18,30,48和72 h)中抗坏血酸-谷胱甘肽(A SA-G SH)循环及A SA合成关键酶L-半乳糖-γ-内酯脱氢酶(G a lLDH)的变化。结果表明,在整个衰老过程中,伴随H2O2含量、质膜相对透性和M DA含量升高,离体苹果叶片中单脱氢抗坏血酸还原酶(M DHAR)活性下降,抗坏血酸过氧化物酶(APX)和脱氢抗坏血酸还原酶(DAHR)活性分别在18和30 h达到最高值,而后开始下降。G a lLDH对苹果叶片离体衰老反应迅速,在6 h活性达到最高,而后开始迅速下降。A SA/DHA,总A SA和总G SH含量随离体培养时间的延续均先上升而后下降,而G SH/G SSG比值在叶片离体衰老过程中一直下降。说明在苹果叶片离体衰老过程中,抗氧化剂A SA代谢主要是通过提高DHAR活性来维持其高水平,抵制衰老。

外源ABA对GalLDH超表达转基因水稻种子萌发和生理指标的影响

采用5 μmol·L^-1的脱落酸(ABA)溶液对GalLDH(L-半乳糖内酯脱氢酶)基因超表达转基因水稻(GO-2)和粳稻野生型品种中花11(WT)的去壳种子进行处理,研究外源ABA对GO-2和WT种子萌发过程中抗坏血酸(AsA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性以及种子萌发率的影响。结果表明:正常培养条件下,GO-2种子的内源AsA含量在萌发前期比WT提高了16%,在萌发中后期提高了35%,差异显著,萌发率也高于WT。另外,ABA处理对处于萌发前期的WT种子抑制作用更为明显,说明内源AsA含量与水稻种子萌发密切相关,内源AsA含量的提高可能打破了种子萌发相关的激素之间的平衡,提高了种子的萌发率。此外,在种子萌发过程中,GO-2和WT的SOD和POD活性变化以及对外源ABA的响应存在差异,充分说明内源AsA与抗氧化酶系统共同参与调控水稻种子的萌发,进一步证实了内源AsA在水稻种子活力保持以及种子萌发中的重要作用。

玉米ZmGLDH基因的克隆与表达分析

为探讨玉米L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因(ZmGLDH)在玉米生长发育和抗逆反应中的作用,采用RT-PCR、生物信息学、实时荧光定量PCR方法,研究了ZmGLDH基因的序列结构及其在盐胁迫下的表达特征。结果表明:ZmGLDH基因有6个外显子、5个内含子,其开放阅读框编码的多肽包含39个氨基酸残基的转运肽、42个氨基酸残基的去除肽段、505个氨基酸残基的成熟肽,在近成熟肽的N-末端有一个136个氨基酸残基组成的FAD结合结构域。盐胁迫下,ZmGLDH基因表达量上调。盐胁迫1 h,其表达量上升至对照(盐胁迫0 h)的1.20倍,盐胁迫2 h上升至对照的2.31倍,盐胁迫3 h为对照的2.20倍,盐胁迫4 h为对照的1.46倍。盐胁迫期间玉米叶片中抗坏血酸(AsA)含量的变化与ZmGLDH基因表达量的变化趋势一致,说明盐胁迫诱导的ZmGLDH基因表达水平变化是影响玉米叶内AsA含量的主要因素。

GLDH超表达水稻愈伤组织的耐盐性研究

为了探讨内源抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)水平对水稻愈伤组织耐盐性的影响,以AsA合成关键酶半乳糖内酯脱氢酶(L-galactono-1,4-lactonedehy drogenase,GLDH)基因超表达型水稻(GO)为材料,研究了盐胁迫(1%NaCl)下GO愈伤组织继代生长及相关抗性生理指标的动态变化。结果表明,盐胁迫下GO愈伤组织生长明显优于野生型(wildtype,WT),表现为生长速率较快,愈伤颗粒较大,致密,呈浅黄色。盐胁迫下GO愈伤组织中还原型AsA与总AsA含量不断下降,DHA含量总体上也呈下降趋势,但其氧化还原势(AsA/DHA)在胁迫初期上升,后期快速下降。进一步研究发现盐胁迫下GO愈伤组织中MDA含量先上升后快速下降,但其含量显著低于WT,而POD活性在胁迫初期略有降低,在后期又快速升高,其活性总体上显著高于对照。因此上述研究表明GLDH超表达水稻愈伤组织的耐盐性增强与其AsA含量提高有关。

白菜GLDH基因cDNA的克隆及序列分析

以白菜品种‘苏州青’cDNA为模板,采用RT-PCR、巢式PCR、3’RACE和5’RACE技术,获得了L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(EC1.3.2.3,GLDH)基因cDNA2034bp全长序列。序列分析表明,GLDH基因cDNA序列编码601个氨基酸。其氨基酸序列与花椰菜GLDH基因具有98%的同源性,与拟南芥GLDH基因具有90%的同源性。该基因在GenBank中登录号为AY899298。

马铃薯抗坏血酸含量及其代谢相关酶活性关系的研究

为探讨马铃薯不同器官中抗坏血酸(AsA)含量及其代谢相关酶活性关系,研究了马铃薯幼叶、功能叶、老叶、茎和块茎中AsA和其氧化态脱氢抗坏血酸(DHA)的含量与L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、抗坏血酸氧化酶(AO)和单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)等6种酶活性之间的相关性。结果表明,马铃薯AsA在幼叶和块茎中含量很高。叶片和茎的抗坏血酸库(AsA与DHA之和)水平与GalLDH活性显著相关,而AsA含量与DHAR活性显著相关,DHA含量与APX活性显著相关。说明在马铃薯幼叶中高含量的AsA可能由于GalLDH和DHAR的高活性;而块茎中AsA的积累,主要来自于叶片的运输和DHAR催化的DHA再生。