一个新的L-半胱亚磺酸脱羧酶基因的分析和突变

【目的】完成一个来源于碱性污染土壤宏基因组文库的新的L-半胱亚磺酸脱羧酶基因undec1A的鉴定,研究其酶学性质并利用非理性设计技术对其进行分子改造。【方法】以p ETBlue-2为表达载体构建包含undec1A基因的重组表达质粒,转化至宿主细胞E.coli Tuner(DE3)p Lac?中构建重组表达克隆,采用镍亲和层析完成了酶蛋白的分离纯化,完成其生化特征研究,利用连续易错PCR技术对Undec1A蛋白进行分子改造。【结果】生物信息学分析结果揭示Undec1A蛋白与已知的L-半胱亚磺酸脱羧酶存在类似的辅酶结合位点和底物识别催化基序等。分子对接结果显示氨基酸残基Val237、Asp239、Asp266、Ile267、Ala268和Lys298等决定了与底物分子L-半胱亚磺酸的识别和结合催化。以L-半胱亚磺酸作为底物,重组Undec1A蛋白的最适作用p H为7.0,最适作用温度为35°C;分子动力学常数K_m为(1.557±0.015)mmol/L,V_(max)为(49.07±3.19)μmol/(L·min),k_(cat)为(45.80±1.32)/min。利用连续易错PCR技术完成了亲本酶的分子改造,分离筛选到了一个酶活力更高的突变酶Undec1A-1180。在优化条件下,Undec1A-1180的比活力较亲本酶提高了约5.62倍。【结论】本研究为构建牛磺酸的生物合成工艺提供了理论参考,因而具有重要的实践意义。

半胱亚磺酸脱羧酶和牛磺酸转运体mRNA在成年小鼠睾丸间质细胞的表达

为检测成年小鼠睾丸间质细胞是否存在牛磺酸生物合成关键酶半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)和牛磺酸转运体(TauT)mRNA的表达,通过Percoll分离液分离纯化成年小鼠睾丸间质细胞,运用RT-PCR方法测定睾丸间质细胞中CSD和TauT mRNA表达情况。结果显示,成年小鼠睾丸间质细胞存在CSD和TauT mRNA表达。说明成年小鼠睾丸间质细胞能通过CSD途径合成牛磺酸以及睾丸间质细胞可能存在牛磺酸的转运活动。

雌二醇和孕酮对小鼠子宫半胱亚磺酸脱羧酶基因表达和牛磺酸含量的调控

实验主要研究了17β-雌二醇(E2)和孕酮(P4)对小鼠子宫组织中半胱亚磺酸脱羧酶基因(CSD)表达和牛磺酸含量的调控。给去卵巢小鼠分别皮下注射植物油(对照组)、17β-雌二醇(E2)、孕酮(P4)、E2和P4、E2和氟维司群(ICI 182780)、P4和米非司酮(RU486),24h后观察各组小鼠子宫中CSD的表达和牛磺酸的含量。Real-time PCR和Western blot定量分析结果显示,每只小鼠注射1μg E2能够显著抑制CSD的mRNA和蛋白的表达,6mg P4能够显著促进CSD mRNA和蛋白的表达,其受体抑制剂RU486和ICI182780都能逆转它们的作用。高效液相色谱(HPLC)测定结果显示,注射1μg E2和6mg P4分别下调和上调子宫组织中牛磺酸的含量。上述结果提示E2和P4可能通过受体途径参与调节子宫CSD的表达,从而调节子宫中牛磺酸含量。

半胱亚磺酸脱羧酶在Ishikawa细胞中的表达与检测

以半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)在Ishikawa细胞中的表达与检测为例,进行了生物技术大实验教学模式的改革。实验首先体外培养人子宫内膜癌Ishikawa细胞,然后分别采用免疫细胞化学、RT-PCR、Western Blot检测了CSD基因在该细胞中的表达。结果表明,在Ishikawa细胞中有CSD mRNA和蛋白的表达。通过完成上述大实验,学生所学的理论知识得到综合应用,培养了创新精神与科学思维。

半胱亚磺酸脱羧酶在成年小鼠副性腺器官中的表达

采用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学方法检测了CSD在小鼠副性腺器官中mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,CSD在小鼠副性腺器官中都有mRNA和蛋白水平的表达。CSD主要定位于精囊腺的高柱状上皮细胞、前列腺的腺上皮细胞和尿道球腺的腺上皮细胞中。结果表明雄性副性腺器官可以通过CSD合成通路参与牛磺酸的合成。

埃及伊蚊来源半胱亚磺酸脱羧酶的性质解析

原核来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶的活性较低,是限制生物法合成β-丙氨酸的主要因素,该研究将目光由原核来源转向真核来源,意在寻找具有更高催化活性的酶。该文通过基因合成获得埃及伊蚊来源半胱亚磺酸脱羧酶,并添加sumo标签实现了其在大肠杆菌中的高效表达,酶学性质表征实验结果表明,重组酶可催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸,比酶活力为(5.00±0.074)U/mg,添加sumo标签后比酶活力为(5.40±0.129)U/mg;最适反应条件为40℃,pH 6.0;带标签酶的稳定性要明显优于野生型,在50℃处理30 min后酶活力仍保留40%,在pH 5.0~8.0酶活力都维持在80%左右。利用大肠杆菌自身的天冬氨酸裂解酶与重组半胱亚磺酸脱羧酶相偶联,实现了从富马酸到天冬氨酸的一步转化,产物的摩尔转化率达到93.03%。该研究中半胱亚磺酸脱羧酶对于L-天冬氨酸具有较高的催化活性,为β-丙氨酸的工业化生产提供理论支持和技术参考。

高效液相色谱法评价海洋生物中半胱亚磺酸脱羧酶活性

[目的]建立磺基丙氨酸(CA)的高效液相色谱分析法,并以CA为底物,评价不同海洋生物组织中半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)的活性。[方法]以Agilent Eclipse XDB-C_(18)为色谱柱,采用邻苯二甲醛(OPA)进行柱前衍生,检测波长为315 nm,对衍生化过程及色谱条件进行了优化。[结果]当CA∶OPA(物质的摩尔比)=1∶2、衍生时间2 min、流动相甲醇∶乙酸钠=65∶35(V/V)、流速1 m L/min时,CA具有最优的检测效果。在该条件下,CA浓度在10～500μg/m L具有良好的线性关系(R^2>0.99),平行样品的相对标准偏差为0.9%～8.6%,保留时间为1.4～1.5 min。不同海洋生物组织中CSD活性检测结果显示,在所选择的海洋贝类、头足类、鱼类中,贻贝、疣荔枝螺和大黄鱼均未检测到CSD活性;蛏子、血蛤、芝麻螺和鱿鱼中CSD活性较低。不同组织比较,海鲈鱼肝脏中CSD活性最高,达21.8 U/mg,而肉和鳃中则未检测到CSD活性。[结论]不同海洋生物体内牛磺酸的合成途径不尽相同。

凡纳滨对虾半胱次磺酸脱羧酶基因的克隆表达

牛磺酸（Taurine）是一种具有多种生物活性的含硫非蛋白氨基酸，在神经系统发育、眼睛发育、渗透压调节等方面有重要功能，目前在饲料、饮料、医药等行业有重要应用。同时其也是鱼类等水产动物风味形成的呈味氨基酸。半胱次磺酸脱羧酶（cysteine sulfinate decarboxylase，CSD）是牛磺酸生物合成的限速酶，在牛磺酸的合成中有重要功能。本研究利用race PCR技术克隆到了凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的半胱次磺酸脱羧酶基因（L．vannamei CSD，LvCSD）的全长序列，对其编码的蛋白的特性进行了分析。同时构建原核表达载体对其进行表达，获得可溶表达的LvCSD，并利用镍柱对其进行纯化，获得较纯的重组LvCSD。另外还发现LvCSD在较盐度为15‰的养殖水体中的凡纳滨对虾的血淋巴细胞和肝胰腺细胞中转录水平较高。

亚硒酸钠在L-半胱氨酸自组装类生物膜修饰电极上的电化学行为

利用L-半胱氨酸自组装膜修饰金电极(L-Cys,Au/SAMs),在0.05mol/L H2SO4底液中研究了Na2SeO3的电化学特性。在0.00～1.30 V(vs.SCE)电位范围内对微量Na2SeO3进行循环伏安扫描,发现L-Cys,Au/SAMs修饰电极在峰电位0.89 V处有灵敏的Se的氧化溶出峰。通过比较裸金电极和修饰电极在Na2SeO3溶液中的电化学特性发现,修饰电极通过巯基中的S与Na2SeO3发生氧化还原作用生成Se,且修饰电极对沉积在电极表面的Se的氧化过程具有催化作用。根据Na2SeO3在单分子膜上的电化学行为,提出了单分子膜中硫(Au-S)与Se(作用生成Se的反应机理、Se电化学催化氧化机理及巯基化合物通过生成纳米硒生物吸收Se的类生物膜模型。

L-半胱氨酸在柠檬酸和氨基磺酸混合介质中对碳钢的缓蚀

采用电化学方法测定了L-半胱氨酸对A3碳钢在柠檬酸和氨基磺酸混合溶液中腐蚀行为的影响,开路电位(OCP)测定结果显示,加入L-半胱氨酸造成开路电位下降,初始L-半胱氨酸浓度越高,开路电位越高.电化学阻抗谱(EIS)测试结果显示,加入L-半胱氨酸后腐蚀反应阻抗越小,腐蚀速率增加.等效电路表明L-半胱氨酸吸附在铁的表面后促进铁和溶液界面中铁的电化学活性,并使得铁表面保护层的厚度降低,Tafel曲线显示加入L-半胱氨酸腐蚀速率增加.吉布斯自由能计算结果显示,L-半胱氨酸和铁离子形成配合物比L-半胱氨酸吸附在碳钢表面更容易发生,导致了铁的溶出,使腐蚀加剧.

鲫鱼(Carassius auratus)半胱亚磺酸脱酸酶CSAD基因克隆及其表达研究

本研究以鲫鱼(Carassius auratus)为研究对象,采用巢式PCR和RACE技术克隆鲫鱼半胱亚磺酸脱酸酶CSAD基因c DNA序列,并且利用实时荧光定量PCR检测了CSAD m RNA在鲫鱼不同组织和昼夜节律中的相对表达水平,同时还研究了牛磺酸对鲫鱼肠道CSAD m RNA表达的影响。结果表明:(1)鲫鱼CSAD基因c DNA序列包含186bp的5?UTR序列,675bp的3?UTR序列,1503bp开放阅读框,编码500个氨基酸。同源性分析表明,鲫鱼和鲤鱼的同源性为97.2%。系统发育分析表明,鲫鱼与鲤鱼之间的亲缘关系最接近,置信度为100。经预测,其编码的蛋白质的分子量和等电点分别为56.82k Da和5.77;(2)Ca CSAD m RNA在肌肉、心脏、肠道及肝脏中的表达水平较高,在脑和鳃组织中的相对表达量较低;(3)鲫鱼肠道CSAD m RNA的相对表达量在6:00am点时最高,9:00pm点时相对表达量最低;(4)鲫鱼CSAD的相对表达丰度随着牛磺酸添加量的增加而逐渐下降。本研究结果不仅有助于理解鲫鱼CSAD基因的分子特征,同时将为进一步研究鱼类CSAD营养调控功能提供理论依据。

L-精氨酸和牛磺酸对同型半胱氨酸诱导平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 观察Ｌ－精氨酸和牛磺酸对同型半胱氨酸（ＨＣＹ）诱导的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖的影响。方法采用同位素技术测定ＶＳＭＣ３Ｈ－ＴｄＲ参入。结果ＨＣＹ可促进ＶＳＭＣ增殖。Ｌ－精氨酸及牛磺酸均可呈剂量依赖性抑制ＨＣＹ诱导的ＶＳＭＣ增殖，且合用Ｌ－精氨酸和牛磺酸的对ＶＳＭＣ增殖的抑制作用明显强于单纯应用Ｌ－精氨酸或牛磺酸组。结论Ｌ－精氨酸和牛磺酸均可抑制ＨＣＹ诱导的ＶＳＭＣ增殖。

CuTsPc-SA/CuTAPc-CS双极膜在成对电合成L-半胱氨酸和L-磺基丙氨酸中的应用

用四磺酸基铜酞菁(CuTsPc)和四氨基铜酞菁(CuTAPc)改性海藻酸钠(SA)阳膜层和壳聚糖(CS)阴膜层,制备了CuTsPc-SA/CuTAPc-CS双极膜(BPM),并以CuTsPc-SA/CuTAPc-CSBPM作为电解槽隔膜,成对电合成L-磺基丙氨酸和L-半胱氨酸。研究结果表明,四磺酸基铜酞菁和四氨基铜酞菁可以促进双极膜中间层水的解离,大大降低膜阻抗和膜电阻压降(即IR降),当电流密度为45mA/cm2时,在1mol/LNa2SO4溶液中,CuTsPc-SA/CuTAPc-CS双极膜的IR降仅为0.3V。综合考虑电流效率和产量两个因素,电合成时电槽的电流密度以35mA/cm2为宜。

分光光度法测定大蒜提取物中硫代亚磺酸酯

提供了一种利用L 半胱氨酸和DTNB检测新鲜大蒜及大蒜提取物中硫代亚磺酸酯的分光光度法 ,通过对Lawson法的进一步改良 ,不仅提高了测定的准确性和重现性 ,而且可应用于大蒜乙醇提取物中硫代亚磺酸酯的定量测定 ,也同样适用于其它大蒜提取物中总硫代亚磺酸酯的定量测定。

半胱亚磺酸脱羧酶在妊娠小鼠子宫和胚胎中的表达定位研究

目的研究半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)mRNA和蛋白在妊娠小鼠子宫和胚胎中的表达定位。方法构建CSD原位杂交探针,收集正常妊娠小鼠第1~9天子宫组织和第11天胚胎,采用免疫组织化学染色、原位杂交检测CSD的表达情况。结果小鼠妊娠第1~2天CSD主要定位在子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞,基质细胞从第3天开始表达,第6天开始胚胎周围的子宫蜕膜细胞中检测不到CSD蛋白,第8天子宫CSD的表达明显减弱,第9天表达更弱。从囊胚到第9天时胚胎都有CSD表达。CSD在第7天定位于着床点子宫和胚胎中,胚胎周围的子宫蜕膜细胞无表达,在第11天定位于胚胎的脑、心脏、脊髓。结论子宫和胚胎在小鼠妊娠过程中可表达CSD。

高效液相色谱法评价海洋生物中半胱氨酸双加氧酶活性

建立半胱亚磺酸的高效液相色谱分析方法,并利用该方法测定不同海洋生物组织中半胱氨酸双加氧酶的活性。应用邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)为衍生试剂进行柱前衍生,色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C_(18)。结果发现,当检测波长为315 nm、半胱亚磺酸与OPA物质的量比1∶2、衍生时间3 min、流动相甲醇-乙酸钠(8∶2,V/V)、流速1 m L/min时,半胱亚磺酸在10~400μg/m L质量浓度范围内具有良好的线性关系(R^2>0.99),平行样品的相对标准偏差为0.9%~6.4%,保留时间为1.46 min。以此方法为基础,对不同海产品组织中半胱氨酸双加氧酶活性进行检测,结果显示,所选择的海洋贝类、蟹类、虾类、鱼类中均检测到半胱氨酸双加氧酶活性,其中南美白对虾中活性最高。不同组织比较,鱼体肝脏中半胱氨酸双加氧酶活性最高,而鳃中活性最低。

培养的钙化大鼠心肌细胞牛磺酸转运障碍

目的探讨离体培养钙化幼鼠心肌细胞牛磺酸(Tau)跨膜转运功能及牛磺酸转运体(TAUT)和半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)mRNA含量的改变及意义。方法以β-磷酸甘油培养心肌细胞;氨基酸分析仪测定细胞牛磺酸含量;3H标记的牛磺酸测定心肌细胞牛磺酸转运;竞争性定量RT-PCR测定心肌细胞TAUT和CSDmRNA水平。结果与非钙化大鼠心肌细胞相比,钙化心肌细胞牛磺酸含量减少27%(P<0.05),细胞3H-牛磺酸摄入程度降低,最大转运速率(Vmax)减少39%(P<0.01),Km值两组间差异无显著性(P>0.05);钙化心肌细胞TAUTmRNA含量减少45%(P<0.01),而CSDmRNA增加25%(P<0.05)。结论钙化心肌细胞牛磺酸转运功能障碍,TAUT表达减少,而CSD表达增加。

基于RhB修饰纳米金电极测定十二烷基苯磺酸钠

借助Au-S的作用,将L-半胱氨酸组装在纳米金电极表面上,利用罗丹明B(Rhodamine B)与L-半胱氨酸之间静电的作用,将罗丹明B间接组装于纳米金电极表面,构建罗丹明B纳米金电极。采用差分脉冲伏安法,研究十二烷基苯磺酸钠在罗丹明B纳米金电极上的电化学反应,实验结果表明,在pH为4.75的醋酸-醋酸钠缓冲液中,罗丹明B纳米金电极在0—2.0×10-6g/L范围测定十二烷基苯磺酸钠的线性较好,对十二烷基苯磺酸钠检出限为2.4×10-9g/L。

猫牛磺酸营养研究进展

猫体内由于缺乏合成牛磺酸的限速酶-半胱亚磺酸脱羧酶,所以不能以蛋氨酸和半胱氨酸为原材料合成机体所需的牛磺酸,需要从动物蛋白中获取。牛磺酸除了可以与胆酸结合生成牛磺胆酸,促进脂肪及脂类物质消化吸收外,还对维护其敏锐的视觉,正常的繁殖、免疫和神经学功能等诸多方面有举足轻重的作用,是十分重要的必需氨基酸。