L-天冬酰胺酶在肿瘤中的研究进展

氨基酸代谢与细胞氧化应激、细胞增殖和细胞凋亡等多种细胞过程相关,参与糖尿病、衰老、肿瘤等生理病理过程。L-天冬酰胺酶(L-asparaginase,L-ASP)是氨基酸代谢途径中的关键酶,能够水解天冬酰胺生成天冬氨酸和氨,参与细胞增殖、凋亡、迁移以及侵袭等生物过程。研究表明,L-天冬酰胺酶影响白血病、乳腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌等多种肿瘤的发生和发展。本文主要从L-天冬酰胺酶的结构、酶学作用、与其他药物联用对多种肿瘤治疗的潜力进行综述。

定点突变提高枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的活力及稳定性

L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。它可以通过降解食品原料中的L-天冬酰胺而降低高温烹制食品中丙烯酰胺的含量。由于食品预处理环境的复杂性,只有具有高酶活且稳定的酶才能满足食品生产中的应用。作者通过点突变提高来源于Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶(Bs AII)的酶活和热稳定性。通过序列比对和同源模拟选择5个点进行突变,构建6个突变菌株。酶活测定结果表明,突变体酶S299N_(ansz)和P348A_(ansz)的酶活较Bs AII分别提高28%和32%。其中P348A_(ansz)的热稳定性和p H稳定性较Bs AII均有明显提高。本研究表明,第299和348位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响,对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础,并提高了该酶的工业应用潜力。

几种因素在L-天冬酰胺酶化学修饰中对酶活力及抗原性的影响

为了寻求在较好地保持酶活力的同时解除L-天冬酰胺酶抗原性的方法,采用不同分子量的乙酸酐、右旋糖酐和单甲氧基聚乙二醇,作为修饰剂和不同的修饰方法对该酶进行了化学修饰。结果表明在保持酶活性和降低抗原性方面,大分子修饰剂右旋糖酐、单甲氧基聚乙二醇优于小分子乙酸酐,底物保护修饰优于直接修饰;活化PEG,优于活化PEG_1。在底物保护下的PEG,修饰酶其抗原性完全解除的同时,酶活力保持在30%以上。

丝素纳米颗粒的制备及应用于L-天冬酰胺酶的固定化

丝素蛋白纤维溶于高浓度中性盐溴化锂溶液或氯化钙-乙醇-水三元溶剂中,经过透析和纯化可以制成3种液态丝素.SDS-PAGE分析结果表明,其分子量分布范围明显不同.应用能与水混溶的有机溶剂如丙酮等可将这种丝素制成丝素纳米颗粒,用SEM观察到丝素纳米颗粒粒径分布范围为50～120nm.以戊二醛为交联剂,将治疗急性淋巴性白血病常用酶制剂L-天冬酰胺酶共价结合在丝素纳米颗粒上.酶活性分析结果表明,由肽链断裂较少的丝素制备的纳米颗粒更适合于酶的生物结合.酶动力学研究结果表明,这种固定化酶活性回收率为44%,热稳定性较游离酶有明显提高,最适pH值范围加宽为6.0～8.0,最适反应温度提高10℃;抗胰蛋白酶水解能力明显增强.结果表明,丝素纳米颗粒与丝素蛋白膜一样,是一种酶固定化的良好载体,在药物缓释系统方面具有潜在的研究和开发价值.

多聚唾液酸对L-天冬酰胺酶的修饰及修饰酶特性研究

The colominic acid was covalently coupled to L asparaginase molecule by reductive amination.Depending on the molar ratios of colominic acid asparaginase (30∶1,50∶1 and 100∶1),a modified enzyme molecule contained 4.7,7.2 and 12 colominic acid molecule,they retained 58%,56% and 33.2% of the initial asparaginase activity,respectively.In comparison with the native enzyme,modified enzyme had lower immunogenicity and antigenicity,longer half life time ( in vitro ),more resistance ability to trypsin proteolysis,and similar Km value for L asparagine.

重组L-天冬酰胺酶Ⅱ的中试工艺及其性质的研究

目的 :通过重组L 天冬酰胺酶Ⅱ中试工艺及其性质的研究 ,旨在获得大量的高纯度产品。方法 :采用 5 0 0L发酵罐发酵 ,对所获得菌体进一步提取纯化 ,产品用还原SDS PAGE(十二烷基硫酸钠 聚丙酰胺凝胶电泳法 ) ,HPLC测定纯度 ,质谱和等电聚焦电泳分别测相对分子质量、等电点 ,并进行了紫外扫描。结果 :发酵液产酶活力达到 2 0 0U·mg-1,提取回收率为80 % ,纯化总回收率为 5 7% ,产品比活为 2 2 0U·ml-1,电泳 30 μg上样量显示一条带 ,HPLC测纯度大于 95 %。该酶Mr为13835 6 ,pI为 4.85 ,紫外最大吸收值在 2 78nm处。 结论 :本研究对实现重组L 天冬酰胺酶Ⅱ的工业化生产有重要意义。

抗肿瘤酶制剂L-天冬酰胺酶治疗白血病的研究进展

L-天冬酰胺酶具有显著的抗肿瘤作用。为了最大限度地发挥酶疗法的优势 ,可以对天然酶进行化学改性、包埋或固定化。尤其值得重视的是固定化酶体外循环净化血浆技术 ,该研究对人类攻克白血病提出了一个新的思路与方法 。

抗癌酶制剂L-天冬酰胺酶在甲壳素上的固定化

研究了以甲壳素为载体固定化 Ｌ天冬酰胺酶的最适条件，探讨了固定化 Ｌ天冬酰胺酶的一系列理化性质。交联剂用量、缓冲液ｐ Ｈ 值和载体活化时间均对 Ｌ天冬酰胺酶的固定化有一定影响，得到的固定化 Ｌ天冬酰胺酶的活力回收可达 ２５．４％ 。固定化 Ｌ天冬酰胺酶理化性质的实验研究表明，酶经固定化后，对蛋白水解酶的稳定性及存贮稳定性均较游离酶有很大程度的提高。

培养基影响大肠杆菌产L-天冬酰胺酶的研究

研究培养基的成分及添加量对大肠杆菌产生抗癌药物—L-天冬酰胺酶的影响。通过对大肠杆菌培养基中碳源、氮源以及微量元素的讨论,得知该菌株以蔗糖为碳源,添加量为0.7%,以0.5%牛肉膏+1.0%蛋白胨为氮源,添加0.01%的硫酸亚铁为微量元素,所产L-天冬酰胺酶的比酶活达到352.54U/g,相比基本培养基培养提高了31%。

大肠杆菌的培养及L-天冬酰胺酶活力的测定

讨论了大肠杆菌 L -天冬酰胺酶发酵液酶活力的影响因素 ,筛选了大肠杆菌产酶的优化条件 .发现了发酵液酶活力的最适 p H随缓冲介质的变化而变化 ;甘氨酸介质中 ,p H 6 .5 0～ 9.5 0均适于酶活测定 ,且 p H 8.0 0时酶活最高 ;硼酸、Tris、磷酸介质中 ,在 p H 8.5 0时 ,酶活力依次下降 ;酶反应的适宜温度 4 0～ 5 0℃ .对菌株培养的研究表明 ,葡萄糖对产酶有抑制作用 ,适当提高摇床转速可使发酵液酶活力由原来的 136 U /m L增至 14 5 U /m L .在确定的最优培养条件 37℃ ,p H 7.0 0 ,2 5 0 r/min下 ,产酶稳定期可持续 12 h.

溶氧对L-天冬酰胺酶发酵的影响及其控制

目的 探索溶氧对L-天冬酰胺酶发酵过程的影响及其控制方法。方法 通过装液量试验、接种量试验、葡萄糖试验和氧载体试验,考察摇瓶发酵过程中溶氧对L-天冬酰胺酶合成的影响,采用通纯氧自控pH的发酵工艺进行溶氧控制和pH控制。结果 采用通纯氧自控pH的发酵工艺,可延长发酵周期,有效防止菌体过早自溶,大大促进L-天冬酰胺酶的合成,较分批发酵提高产酶83％,达到110u/ml。发酵动力学特性分析表明,该发酵方式L-天冬酰胺酶的合成与菌体生长不相关,控制比生长速率μ为0.15～0.301/h,均有利于L-天冬酰胺酶的合成,可使Qp_(max)达到3922mmol/g.h。结论 溶氧对大肠杆菌L-天冬酰胺酶的合成有严重影响,已建立了控制溶氧的发酵工艺。

L-天冬酰胺酶B细胞表位研究

采用ELISA竞争抑制法和光学干涉生物传感器试验对预测的7个段肽进行抗原性鉴定。结果表明7段合成肽中,f（192TPARKHTS199）和g（280AKNGTA286）肽段抗原性较强。研究探索了光学干涉生物传感器在B细胞表位研究中的应用,为进一步抗原位点精细定位打下良好的实验基础。

氧载体对L-天冬酰胺酶发酵过程影响的研究

以抗癌药物Ｌ天冬酰胺酶生产为应用背景，针对发酵过程中存在严重耗氧问题，研究了氧载体对发酵过程的影响。通过对几种氧载体的筛选，认为正十二烷最适合于该发酵过程。随后以产物Ｌ天冬酰胺酶活性、菌体浓度以及溶氧水平为主要指标，考察了氧载体在发酵过程中的作用，实验表明，发酵基质中５％正十二烷的添加量为最佳浓度，这种氧载体的加入，明显地提高了发酵介质中的溶氧水平，改善了供氧条件，增加了菌体浓度，提高了Ｌ天冬酰胺酶发酵水平，在优化条件下。

胞外表达L-天冬酰胺酶发酵条件的研究

[目的]优化胞外表达L-天冬酰胺酶工程菌的发酵条件。[方法]用正交试验研究培养基的组成,用单因素试验研究诱导条件以及通气量对酶产量的影响。[结果]发酵培养基采用8.0%玉米浆和1.0%甘油组成;诱导剂采用终浓度为0.5g/L的乳糖,扩大培养后10h加入,诱导时间为12h,通气量为0.83VVM。[结论]该研究为胞外表达L-天冬酰胺酶的工业化生产提供了参考。

用活化的单甲氧基聚乙二醇修饰L-天冬酰胺酶

使用活化的单甲氧基聚乙二醇 ( m PEG2 )对 L -天冬酰胺酶进行修饰 ,修饰过程中加入底物 L-天冬酰氨保护酶的活性中心。得到的修饰酶抗体结合能力消失 ,保留酶比活力 32 .8% ,酶的常温稳定性和热稳定性均有显著提高。荧光胺法分析残余氨基数目得出酶分子的 92个自由氨基中有5

固定化L-天冬酰胺酶间歇催化反应的动力学模型

测定了３７°Ｃ下以固定化Ｌ－天冬酰胺酶为催化剂，５０μｍｏｌ／ＬＬ－天冬酰胺的Ｔｒｉｓ缓冲液（ｐＨ＝７．４）为底物的时歇反应转化率，并用建立的数学模型对反应过程进行拟合。计算结果表明，提出的传质－催化反应动力学模型能较好地描述反应过程，并揭示固定化酶的传质－催化过程受扩散作用控制。

重组L-天冬酰胺酶的鉴定

目的 :对重组L 天冬酰胺酶进行鉴定。方法 :用基因测序、氨基酸组成分析、N 末端氨基酸测序、胰肽图谱、IEF、分子量、紫外扫描等各种实验手段对重组L 天冬酰胺酶及其天然品进行了全面比较。结果 :重组产品与天然品具有同质性。结论 :重组L 天冬酰胺酶具有较好的应用前景。

E·coli L-天冬酰胺酶B细胞抗原表位氨基酸残基Lys^(196)对其抗原性的影响

目的:研究重组E.coli L-天冬酰胺酶B细胞抗原表位中关键氨基酸残基对其抗原性的影响。方法:以Ala为替代残基,对抗原表位192TPARKHTS199中Lys196进行PCR定点突变,双向免疫扩散法和间接ELISA法分析新型重组E.coli L-天冬酰胺酶的抗原性。结果:采用双向免疫扩散法和间接ELISA法检测,与重组E.coli L-天冬酰胺酶相比,新型重组E.coliL-天冬酰胺酶与重组E.coli L-天冬酰胺酶抗体结合率下降64%。结论:通过对重组E.coli L-天冬酰胺酶B细胞抗原表位关键残基的定点突变有效地降低了其抗原性。

pH对L-天冬酰胺酶发酵的影响及其控制

pH对大肠杆菌L-天冬酰胺酶的产生有很大的影响。通过对不同缓冲体系试验和对摇瓶发酵过程pH变化的分析,了解摇瓶发酵过程中pH对L-天冬酰胺酶合成的影响。采用流加磷酸自控L-天冬酰胺酶发酵过程的pH,可延长发酵周期,有效地防止菌体的过早自溶,大大促进L-天冬酰胺酶的合成,较分批发酵提高产酶 83%,达到 110u/mL。发酵动力学特性分析表明,该发酵方式L-天冬酰胺酶的合成与菌体生长不相关,控制比生长速率μ为 0. 15~0. 30h-1,均有利于L-天冬酰胺酶的合成,可使比产酶速率的最大值Qpmax达到 3 922u/(g·h)。

重组L-天冬酰胺酶制剂稳定性研究

通过筛选 L -天冬酰胺酶的稳定剂实验 ,表明甘露醇能增强 L -天冬酰胺酶的稳定性。在避光条件下 ,以甘露醇为稳定剂 ,L -天冬酰胺酶溶液 (酶∶甘露醇为 1∶ 2 ,W/ W) ,2 5℃时贮存期为 2 .5个月 ;冻干制品 (酶∶甘露醇为 1∶ 1,W/ W) ,2 5℃时贮存期为 2 .76年。