重组L-天冬酰胺酶Ⅱ的中试工艺及其性质的研究

目的 :通过重组L 天冬酰胺酶Ⅱ中试工艺及其性质的研究 ,旨在获得大量的高纯度产品。方法 :采用 5 0 0L发酵罐发酵 ,对所获得菌体进一步提取纯化 ,产品用还原SDS PAGE(十二烷基硫酸钠 聚丙酰胺凝胶电泳法 ) ,HPLC测定纯度 ,质谱和等电聚焦电泳分别测相对分子质量、等电点 ,并进行了紫外扫描。结果 :发酵液产酶活力达到 2 0 0U·mg-1,提取回收率为80 % ,纯化总回收率为 5 7% ,产品比活为 2 2 0U·ml-1,电泳 30 μg上样量显示一条带 ,HPLC测纯度大于 95 %。该酶Mr为13835 6 ,pI为 4.85 ,紫外最大吸收值在 2 78nm处。 结论 :本研究对实现重组L 天冬酰胺酶Ⅱ的工业化生产有重要意义。

重组大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ中残余DNA的检测

用地高辛标记工程菌DNA片断作探针 ,通过分子杂交和免疫显色检测重组天冬酰胺酶半成品中的残余DNA。该法对半成品用氯仿抽提 ,消除了蛋白质对DNA测定的干扰。 3批重组门冬酰胺酶半成品的测定结果表明 ,其残余DNA均小于 10 0 pg/剂量。

杆状病毒GP64表面展示元件与L-天冬酰胺酶Ⅱ融合表达的初步试验

GP64是Ⅰ型杆状病毒的主要囊膜糖蛋白,利用基因重组技术在gp64中插入外源蛋白基因,二者在病毒表面融合表达活性肽或蛋白质,可以免去纯化表达产物的繁琐。L-天冬酰胺酶Ⅱ(ASP)是一种临床上广泛使用的蛋白类抗肿瘤药物,利用家蚕杆状病毒(BmNPV)GP64展示系统表面展示ASP,探讨以表面展示有ASP蛋白的出芽型病毒粒子(BV)生产抗肿瘤药物的可行性。构建重组转移载体pFast Bacdual-gp64sp-asp-gp64ctd,并转化E.coli DH10BacTM,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒DNA,将重组杆粒DNA通过脂质体转染至Bm N细胞,获得了重组病毒。重组病毒大量感染Bm N细胞后72 h,收集感染病毒的细胞培养液超速离心纯化BV。采用奈氏试剂法检测接种重组病毒的Bm N细胞内表达融合ASP的酶活力为1 788.4U/mg;Western blot检测纯化后的BV中含融合ASP蛋白,然而BV中的ASP检测不出酶活性。试验结果提示,构建的杆状病毒GP64展示系统可以将ASP转到BV上,但产物的活性保持有待进一步研究。

大肠杆菌Nissle1917L-天冬酰胺酶Ⅱ基因在大肠杆菌BL21中的表达与抗肿瘤活性

【目的】从大肠杆菌Nissle1917中获得L-天冬酰胺酶Ⅱ基因,并研究其抗肿瘤活性。【方法】以大肠杆菌Nissle1917基因组为模板PCR扩增L-天冬酰胺酶Ⅱ基因,克隆至可诱导表达载体pET28a上。将L-天冬酰胺酶Ⅱ表达载体pET28a-asp转化至大肠杆菌BL21(DE3)中并通过IPTG诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和液相色谱-质谱(LC-MS)对表达的L-天冬酰胺酶Ⅱ进行鉴定,并通过镍柱亲和层析纯化收集表达出的L-天冬酰胺酶Ⅱ。用纯化定量以后的L-天冬酰胺酶Ⅱ作用小鼠乳腺癌4T1细胞、人肝癌Hep-3B细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC。【结果】来自于大肠杆菌Nissle1917的L-天冬酰胺酶Ⅱ基因可在大肠杆菌BL21中高效表达并通过LC-MS得到鉴定,细胞毒性实验结果表明L-天冬酰胺酶Ⅱ对4T1细胞和Hep-3B细胞的生长具有较强的抑制作用,而对人脐静脉内皮细胞HUVEC的生长无明显抑制效果。【结论】来源于大肠杆菌Nissle1917的L-天冬酰胺酶Ⅱ能显著抑制4T1细胞和Hep-3肿瘤细胞的生长,而对人正常组织细胞的生长无明显抑制效果,为进一步研究L-天冬酰胺酶Ⅱ特异性抗肿瘤作用机制和对实体瘤的应用研究奠定了重要基础。

天冬酰胺酶胞外表达的初步研究

[目的]为降低L-天冬酰胺酶Ⅱ的生产成本提供依据。[方法]通过PCR反应扩增大肠杆菌JM109成熟区的L-天冬酰胺酶II基因(ansB),将扩增片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒pMD18-T-asp。对pMD18-T-asp与质粒pET-22b进行双酶切后,将它们连接起来,转化感受态细胞,筛选重组表达载体pET-22b-asp。利用重组表达载体pET-22b-asp转化BL21(DE3),并对其发酵条件以及分离、纯化工艺进行了初步研究。[结果]成功克隆长度为960 bp的L-天冬酰胺酶II基因。重组表达载体pET-22b-asp也构建成功,并在BL21中得到表达。在重组菌接入TB培养基后2 h加入IPTG、培养基的初始pH值为7.2、装液量为12%,L-天冬酰胺酶Ⅱ酶活最高。重组天冬酰胺酶的纯化收率为82%,比活力达196 U/mg。[结论]重组天冬酰胺酶的胞外表达大大简化了其分离步骤。

PSO-SVR算法在发酵过程控制中的应用

针对发酵过程中生物参数难以实时在线测量的问题,建立了用于生物参数状态预估的支持向量机软测量模型。考虑到该支持向量回归模型的复杂性和推广能力的好坏很大程度上取决于其3个参数(ε,C,γ)能否取到最优值,采用粒子群算法实现对参数(ε,C,γ)的同时寻优。在此基础上,以L-天冬酰胺酶Ⅱ为对象,建立其基于PSO-SVR的发酵过程产物浓度状态预估模型。发酵罐控制结果表明:该模型具有很好的学习精度和泛化能力,可实现对L-天冬酰胺酶Ⅱ产物浓度的实时在线预估。