聚丙烯酰胺-聚乙二醇对L-天门冬酰胺酶的包埋研究

以聚丙烯酰胺/聚乙二醇为载体制备了固定化L-天门冬酰胺酶。对固定化酶载体材料——凝胶的溶胀比、机械强度及其影响因素进行了研究。结果表明,单体及交联剂浓度是影响凝胶性能的重要因素,聚乙二醇作为稀释剂能有效控制聚合速率,提高凝胶的溶涨性能和韧性。此外考察了酶负载量、pH值和温度等因素对固定化酶活性的影响。实验结果还表明分批反应6次或存储42天后,固定化酶仍保持较高的活力。

壳聚糖修饰L-天门冬酰胺酶对酶活及抗原的影响

采用水溶性壳聚糖对 L-天门冬酰胺酶进行化学修饰 ,修饰后的酶活回收率高达 70 % ,修饰酶的比活为每毫克蛋白质 1 2 1 .79U,p H值为 7.4,更接近于人体血浆 p H值 (7.2～ 7.4) ,对底物的亲和力有所提高 ,稳定性增加 ,抗原性仅为自然酶的 1 / 3 ,增加了临床使用的安全性。

β-环糊精对L-天门冬酰胺酶的稳定作用

目的 研究 β -环糊精 (β-CD)对L -天门冬酰胺酶 (L -Asnase)稳定性的影响。 方法 用 β -CD对L -Asnase进行修饰 ,并对修饰后酶的热稳定性和抗胰蛋白酶水解能力进行了研究。结果 修饰后酶的热稳定性和抗胰蛋白酶水解能力明显提高。结论 β -CD对L

壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体的稳定性

考察壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体在体外的稳定性。分别从最适pH、最适温度、储存稳定性、酸碱稳定性、热稳定性,以及抗胰蛋白酶水解的能力等方面,对比游离L-天门冬酰胺酶及壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体。结果表明:游离L-天门冬酰胺酶和壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体的最适pH分别为7.5和7.0,最适温度分别为60℃和50℃,壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体的储存稳定性、酸碱稳定性、热稳定性,以及抗胰蛋白酶水解的能力均优于游离酶。因此,壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体能明显提高游离酶的稳定性。

L-天门冬酰胺酶II的表达与纯化

依据发表的大肠杆菌天门冬酰胺酶II基因序列 ,合成引物 ,利用PCR技术获得天门冬酰胺酶II的结构基因 ,插入高效表达载体pBV2 2 0 ,并转化大肠杆菌菌株DH5α ,获得高效表达天门冬酰胺酶II的基因工程菌株。通过对包涵体的提取与纯化 ,结合离子交换层析获得天门冬酰胺酶II的蛋白质纯品。检测结果表明得到的天门冬酰胺酶II具有较高的比活性 ,与商品化的同类产品比活相近。

用氨气敏电极测定L-天门冬酰胺酶的活力

本文建立了用氨气敏电极测定发酵液和细胞悬浮液中L-天门冬酰胺酶的方法,发现样品中加入的一些化学试剂对测定结果有影响,而将样品稀释到一定程度可以消除这些影响。实验结果表明,用氨电极测定的精密度优于用奈斯勒试剂测定的精密度。

用盐酸胍和Triton X-100从大肠杆菌细胞内释放L-天门冬酰胺酶

研究了用盐酸胍和TritonX 10 0处理ATCCEscherichiacoli 1130 3细胞 ,使细胞内的L-天门冬酰胺酶 (EC 3.5 .1.1)释放到细胞外的方法 ,发现盐酸胍和TritonX 10 0结合使用的效果好。考察了盐酸胍浓度、TritonX 10 0浓度、大肠杆菌细胞浓度、处理时间、pH值等因素对L -天门冬酰胺酶释放的影响。结果表明 ,0 .75～ 1mol/L盐酸胍、2 %TritonX 10 0、细胞浓度 3.2× 10 8/ml、pH 7.0、15℃处理 16～ 2 0h后 ,酶的释放率达到 6 0 %左右。这种方法操作简便 ,酶的释放率较高 ,但对酶无明显的选择性。

重组L-天门冬酰胺酶II的液相色谱/电喷雾离子化质谱法分析

目的 对基因重组L 天门冬酰胺酶II产品进行一级结构分析。方法 采用流动注射方式 ,电喷雾离子化质谱法测定分子量 ;三氯乙酸变性 ,胰蛋白酶水解后 ,HPLC测定肽图谱 ;结合质谱源内碰撞诱导解离技术 ,解析酶解肽段的氨基酸顺序。结果 分子量测定值与理论值不符 ,质谱解析表明样品中存在 3个氨基酸变异现象 ,由此计算的分子量与测定值吻合。结论 液相色谱 /电喷雾质谱法为基因重组蛋白质药物的一级结构分析和质量控制提供了新途径。

右旋糖苷对大肠杆菌L-天门冬酰胺酶Ⅱ的化学修饰

用高碘酸氧化法活化的右旋糖苷对大肠杆菌 L-天门冬酰胺酶进行化学修饰 ,修饰反应的酶活力回收率为 4 6 .8% ,修饰酶冻干品比活为 118.4 IU/ mg蛋白质。酶经修饰后 ,对底物的亲和力未发生变化 ,但抗胰蛋白酶水解能力明显提高 。

聚乙二醇改性壳聚糖固定化L-天门冬酰胺酶的工艺研究

采用交联法制备了聚乙二醇改性壳聚糖(PEG-CS)载体,并将其用于固定化L-天门冬酰胺酶。研究了聚乙二醇浓度、交联剂戊二醛浓度、活化剂甲醛浓度、酶溶液浓度等因素对PEG-CS固定化L-天门冬酰胺酶活力的影响。结果表明:在适当的条件下,PEG-CS固定化L-天门冬酰胺酶的活力可达20～40U/g,并且PEG-CS固定化L-天门冬酰胺酶具有良好的生化性质。

用双水相系统从大肠杆菌细胞内释放L-天门冬酰胺酶

聚乙二醇－磷酸盐双水相系统可以释放大肠杆菌ＡＴＣＣ１１３０３细胞内的Ｌ－天门冬酰胺酶。研究了聚乙二醇、磷酸氢二钾的浓度对酶和蛋白质的释放及分配的影响。在双水相系统中加入适量的盐酸胍和ＴｒｉｔｏｎＸ１００可以提高酶的释放量。实验表明，用新的下相代替富含酶的下相，上相能够重复使用几次。这种方法将酶的释放和萃取结合为一个步骤。

R质粒对大肠杆菌L-天门冬酰胺酶活力的影响

对含有不同R质粒的6株大肠杆菌J53和不含质粒的大肠杆菌J53所产生的L-天门冬酰教酶的活力进行了比较,前者的L-天门冬酰胺酶活力比后者的降低了约1/2—3/4。消除大肠杆菌J53细胞中的R质粒后,L-天门冬酰胺酶活力明显增加并与不含质粒的大肠杆菌J53的相近。结果表明,在大肠杆菌内存在的R质粒对寄主的L-天门冬酰胺酶活力具有明显的抑制作用。

聚乙二醇改性壳聚糖固定化L-天门冬酰胺酶反应性质研究

研究了聚乙二醇改性壳聚糖(PEG-CS)固定化L-天门冬酰胺酶催化缓冲液中天冬酰胺的反应过程,考察了底物浓度、给酶量、温度、搅拌速率等条件对固定化酶在缓冲液中间歇催化反应过程的影响;以及底物浓度、流量、温度、床层高度等因素对固定化酶在缓冲液中连续催化反应过程的影响。实验结果表明:在适当的反应条件下,聚乙二醇改性壳聚糖固定化L-天门冬酰胺酶可以很好地水解缓冲液中的天冬酰胺。

用双水相系统释放大肠杆菌L-天门冬酰胺酶

A method to release L-asparaginase（EC3.5.1.1） from E sc herichia coli ATCC 11303 cells using an aqueous two-phase system was proposed . The system was composed of K2HPO4 and polyoxyethylene octyl phenyl ether （POOPE）. This method combined enzyme release with enzyme purification.The influences of POOPE concentration, K2HPO4 concentration,E. coli cel l concentration,pH and treatment time on the release of L-asparaginase were inv estigated.Under suitable conditions,over 90% of L-asparaginase in cells was re leased into surrounding medium.Electron micrography indicated that the chemical treatment altered the inner str ucture of E.coli cells significantly.

固定化L-天门冬酰胺酶的性质及其填充床反应器的研究

利用海藻酸钙包埋、戊二醛交联的方法对L-天门冬酰胺酶进行固定化。研究了固定化L-天门冬酰胺酶的最适pH、最适温度、米氏常数、半衰期等酶学性质,并考察了影响固定化酶柱式填充床反应器转化率的因素。结果表明:固定化酶最适pH值为8.5,最适温度为67°C,固定化酶的米氏常数Km增大,固定化酶半衰期随着温度的增加而逐渐减小;温度、反应柱内径、底物溶液浓度、流速等因素对填充床反应器转化率均有显著影响。

L-天门冬酰胺酶的提取和纯化工艺改进

目的 改进L 天门冬酰胺酶的提纯工艺 ,使成品达到中国药典标准。方法 在工艺流程中改溶菌酶破壁、蔗糖提取为丙酮破壁、稀盐提取 ,并增加了亲和层析的工序。结果 提取的L 天门冬酰胺酶比活力提高到 2 5 0IU/mg ,纯度达到 98%以上 ,产率达到 40 %。结论 本工艺优于吴氏工艺 。

降低L-天门冬酰胺酶毒副作用的研究进展

L 天门冬酰胺酶是儿童急性淋巴细胞白血病诱导治疗中不可缺少的重要药物 ,但其毒副作用限制了该酶的临床应用。目前如何减少L 天门冬酰胺酶的毒副作用是进一步推广应用的研究重点 ,本文对其作简要的综述。

壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体血浆稳定性及药动学的初步研究

目的考察壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体的血浆稳定性及药动学特性。方法血浆稳定性:于不同时间点,分别测定L-天门冬酰胺酶和壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体在大鼠空白血浆中的活性。大鼠静脉注射L-天门冬酰胺酶和壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体后,分别考察其药动学特性。采用DAS药动学软件计算药动学参数。结果在空白血浆中,壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体的活性高于L-天门冬酰胺酶;壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体的活性-时间曲线下面积(AUC_(0-48 h))约为L-天门冬酰胺酶的3.3倍,壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体的平均滞留时间(MRT_(0-48 h))约为ASP的2.3倍。结论壳聚糖修饰的L-天门冬酰胺酶脂质体能提高L-天门冬酰胺酶的血浆稳定性及生物利用度。

N,O-羧甲基壳聚糖修饰对L-天门冬酰胺酶血浆半衰期及其他性质影响

将具有抗癌作用的L-天门冬酰胺酶用N,O-羧甲基壳聚糖进行化学修饰,以降低酶的抗原性,提高其在体内的半衰期.实验结果表明,修饰酶的表观K_m值与自由酶相差不多,分别为2.6×10^(-4)mol/L和2.2×10^(-4)mol/L(20℃),而抗胰蛋白酶和糜蛋白酶水解能力有很大提高.酶经修饰后抗原性大大降低,且修饰剂分子量越高,降低抗原性的效果越好.自由酶在兔体内的半衰期为1.2h,而修饰酶为40h,提高了33倍.