基于提高L-异亮氨酸生产效率谷氨酸棒杆菌构建和混菌发酵

L-异亮氨酸是多数哺乳动物必需氨基酸,广泛应用在食品、医药、运动营养等领域。为促进细胞内L-异亮氨酸外排,提高发酵液中L-异亮氨酸含量,以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)IBCL-1为出发菌株,构建CI01、CI02、CI03与IBCL-1ΔlysA 4株菌株。通过发酵对比CI01、CI02、CI03菌株生产L-异亮氨酸能力,其中CI01菌株L-异亮氨酸产量最高为21.36 g·L^(-1),相较于出发菌株IBCL-1提高6.8%。为降低主要副产物L-赖氨酸含量,敲除合成IBCL-1中L-赖氨酸关键基因lysA,所获菌株IBCL-1ΔlysA可大量消耗外源L-赖氨酸。最后将CI01与IBCL-1ΔlysA菌株混合发酵生产L-异亮氨酸,确定13:1为两种菌接种量最佳配比,发酵液中L-异亮氨酸含量为22.96 g·L^(-1),L-赖氨酸含量为0.42 g·L^(-1),显著提高L-异亮氨酸生产效率。

L-异亮氨酸产生菌的选育及其发酵条件优化

根据代谢控制发酵原理 ,经硫酸二乙酯诱变处理 ,定向选育出具有Met-+Ethr+α ABr+AECr 遗传标记的目的突变株ISW330。采用均匀设计法考查了发酵培养基中几种主要成分对L 异亮氨酸发酵的影响 ,通过MATLAB软件获得最佳发酵培养基配比 ,并对该目的突变株的摇瓶发酵条件进行了研究。在最佳条件下该菌株可产L 异亮氨酸 2 0 2 g/L。

营养及环境条件对黄色短杆菌WL-10发酵生产L-异亮氨酸的影响

研究了能积累 L 异亮氨酸的黄色短杆菌WL 10的菌体生长规律 ,并讨论了葡萄糖、玉米浆以及磷酸盐等几个主要的营养物质对其积累L 异亮氨酸的影响 ,确定了较优的发酵条件为 :葡萄糖 12 % ,(NH4) 2 SO42 % ,玉米浆 2 % ,KH2 PO40 1% ,MgSO40 0 5 % ,CaCO33% ,种龄 9h ,接种量为 6 %。在此条件下 72h摇瓶产酸可达 2 3%左右。在上述基础上 ,研究了不同温度对WL 10积累L 异亮氨酸的影响 ,提出了分阶段变温控制的操作模式 ,即 0～2 5h ,培养温度为 31℃ ,2 5h后将温度降为 2 8℃ ,采用 5L罐实验 6 0h可积累L 异亮氨酸2 5 %。

L-异亮氨酸型配体交换固定相对DL-氨基酸的拆分研究

用自制的新型L 异亮氨酸配体交换固定相在配体交换模式下对 11种DL 氨基酸进行了拆分研究,详细考察了流动相中铜离子浓度、甲醇含量、流速及温度对拆分效果的影响,并探讨了可能的拆分机理。研究结果表明:流动相中高浓度的铜离子不利于DL 氨基酸的拆分;增加流动相中甲醇的含量,降低流动相流速以及提高色谱柱温度均可改善拆分效果。

L-异亮氨酸发酵培养基的响应面法优化

借助于SAS软件 ,采用Plackett Burman试验设计法及响应面法分析 ,对L 异亮氨酸产生菌BrevibacteriumflavumTC 2 1进行了发酵培养基的优化研究。在初始发酵培养基的基础上寻优 ,优化后的发酵培养基使TC 2 1菌株的L 异亮氨酸产率提高了 2 2 5 2 %。

二(2-乙基己基)磷酸萃取L-异亮氨酸的研究

以二(2-乙基己基)磷酸(D2EHPA)-正辛烷及D2EHPA-正辛醇萃取L-异亮氨酸为对象，研究了D2EHPA浓度、L-异亮氨酸初始浓度以及pH值对萃取平衡分配系数的影响。结果表明，在实验研究涉及的pH值范围内，分配系数先随pH的增加而增大，在3.5<pH<5区域，pH值对分配系数的影响较小。分配系数还随D2EHPA浓度的增加而增大。正辛醇加入有机相，萃取分配系数增大。D2EHPA与L-异亮氨酸生成萃合比为1∶1或2∶1的萃合物。证实了在D2EHPA萃取L-异亮氨酸的过程中存在着质子转移反应。建立的萃取平衡分配系数关联式的拟合精度是令人满意的。

双底物指数流加和双阶段溶氧控制对谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸的影响

为了实现L-异亮氨酸的高效生产,提高谷氨酸棒状杆菌YILW生产L-异亮氨酸的产量和生产强度,在详尽分析磷酸盐和玉米浆初始浓度对L-异亮氨酸发酵影响的基础上采用了双底物(玉米浆、磷酸盐)指数流加与双阶段溶氧相结合的控制策略进行L-异亮氨酸发酵。结果表明,最佳磷酸盐和玉米浆浓度分别为1.5 g/L和35 mL/L,此条件下分批补料发酵菌体生物量和L-异亮氨酸产量分别为27.66 g/L和25.89 g/L。在生长阶段进行双底物指数流加并结合双阶段溶氧控制,发酵60 h菌体生物量和L-异亮氨酸产量分别为32.29 g/L和31.32g/L,较优化前分别提高16.73%和20.97%。

响应面法优化L-异亮氨酸产生菌的摇瓶发酵条件

对黄色短杆菌突变株BM2610生产L-异亮氨酸的摇瓶发酵条件进行了研究.单因素优化了菌株BM2610的发酵培养基与培养条件,确定了发酵培养基的最佳碳氮源、最适起始pH、装液量及接种量等,进一步通过响应面分析方法优化了发酵培养基的组成配比.结果在优化条件下,BM2610摇瓶发酵平均积累L-异亮氨酸16.11 g·L^(-1),比未优化前提高了126.3%.

柠檬酸钠对L-异亮氨酸发酵及代谢流量分布的影响

分析黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)中L–异亮氨酸生物合成途径得知,添加柠檬酸钠利于L–异亮氨酸发酵.通过考察柠檬酸添加量对副产物含量、菌体生物量、菌体比生长速率及L–异亮氨酸产量的影响,得出柠檬酸钠的最适添加量为2.0 g/L.应用代谢流分析方法研究了柠檬酸钠对L–异亮氨酸发酵中后期细胞内代谢流分布的影响.结果表明,在初始发酵培养基中添加2.0 g/L柠檬酸钠后,合成副产物的代谢流量明显减少,EMP途径代谢流从63.34减弱至46.54,而L–异亮氨酸的生物合成代谢流增长至23.28,较添加前提高了5.91%,且产量提高了7.87%.因此,发酵过程中添加柠檬酸钠可有效减少副产物的生成,提高L–异亮氨酸生物合成途径的代谢流量.

均匀设计在L-异亮氨酸发酵中的应用

本试验用均匀设计方法考查了9种培养基组成对L-异亮氨酸产生菌钝齿棒状杆菌(Cory-nebacterium crenatum)A11发酵的影响,获得优化配比为:葡萄糖12%,硫酸铵2%,磷酸二氢钾0.1%,磷酸氢二钾0.45%,硫酸镁0.055%,生物素1μg,硫胺素15μg,硫酸亚铁2ppm,硫酸锰2ppm,碳酸钙4%,pH7.0～7.2。在此条件下,菌株A11可产生L-异亮氨酸15.1mg/ml。与正交设计相比,均匀设计具有试验次数少,工作效率高和便于分析因素影响等优点。

L-异亮氨酸发酵培养基的遗传算法优化及发酵过程的神经网络建模

应用遗传算法对L-异亮氨酸发酵培养基进行优化,经优化后的发酵培养基能积累L-异亮氨酸16.84g/L,比初始值提高28.7%.并且运用神经网络对L-异亮氨酸的发酵过程进行建模并预测,取得了良好的效果.结果表明,神经网络在L-异亮氨酸发酵的模拟与预测中是一种高效快速的方法.

分批补料培养对L-异亮氨酸发酵的影响

以钝齿棒杆菌 (CorynebacteriumcrenatumMet-,Bio-,AECr,AHVr)的分批补料技术进行L -异亮氨酸 (L -ILE)发酵调控的研究。采用间歇恒速补料方式 ,当初糖浓度由 7%下降至 1 %～ 2 % ,补糖为 2 3g/L·h ,整个发酵过程糖浓度一直维持在 2 % ,μ、x值都提高 ,qp 为最大 ;L -亮氨酸产率达 1 7.4g/L ,产酸率提高 2 1 % ,结果明显优于分批培养。

应用原生质体融合技术选育L-异亮氨酸生产菌

以黄色短杆菌WY10和ASl.495为亲本菌株,分别摸索了其原生质体形成和再生的条件,并在此基础上,进行了原生质体融合试验,考察了PEG浓度、融合时间等条件对原生质体融合的影响;最后利用所确定的条件对两亲株进行了融合,筛选出目的融合子WYA09和WYAl7,带有双亲株标记Met-和Leu-。经产酸验证后,产酸量没有大幅提高,但副产氨基酸(主要是亮氨酸)减少,对工业生产中分离提纯工作和下一步的筛选高产菌工作都大有益处。

供氧对L-异亮氨酸分批发酵的影响

对黄色短杆菌L 异亮氨酸高产菌XQ 4 (AHVrAECrSucgSGrEthrα ABrIleHxr)分批发酵供氧需求进行了研究 .在 2L台式发酵罐中进行分批发酵 ,当体积传氧系数 (Kla)为 385h 1左右时 ,供氧比较适宜 ,在 138g/L的葡萄糖溶液中可产生 2 3.5 g/LL

L-异亮氨酸菌种选育及发酵条件优化

以栖糖蜜棒杆菌（Corynedacterium melassecola）ATCC17965为出发菌株。根据代谢控制发酵原理。经硫酸二乙酯和60^Co诱变处理。定向选育出一株L-异亮氨酸产生菌131-5（SG^r＋LeuME^r＋Leu＋AHV^r＋Suc^g＋Eth^r）。在培养基未经优化的情况下产L-异亮氨酸14-15g／L．同时，考察了培养基及发酵每件对茼株产酸的影响，在优化的培养基和发酵条件下积累L-异亮氨酸19．2g／L．最高时可迭21．3g／L．

HPLC-ELSD法定量测定发酵液中的L-异亮氨酸

采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）定量测定发酵液中L-异亮氨酸的含量。结果表明，L-异亮氨酸浓度在0．960～2．880g／L时，其峰面积（y）与相应的浓度（X）呈线性关系，线性方程为Y=0．6615X-0．2439，相关系数为0．9997。L-异亮氨酸的平均回收率为99．08％～101．3％，相对标准偏差为0．56％～1．32％。方法的精密度、准确度好，稳定性高，能简便、快速、准确地测定发酵液中L-异亮氨酸的含量。

过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中hom基因编码的高丝氨酸脱水酶为L-异亮氨酸合成过程的关键酶,本研究通过在L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶,考察过表达高丝氨酸脱水酶对发酵L-异亮氨酸产量的影响.以L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW基因组为模板克隆hom基因,将hom基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom,再转入C.glutamicum YILW构建C.glutamicumYILW(pXMJ19-hom).通过5,L罐发酵研究重组质粒对工程菌的生长、耗糖、L-异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响.结果显示,重组酶的表达使菌株对L-苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强.最终L-异亮氨酸和L-蛋氨酸积累量分别为36.5,g/L和2.8,g/L,分别较出发菌株提高7%和33%,同时L-赖氨酸合成量仅为2.1,g/L,较出发菌株降低了63.8%.

L-异亮氨酸聚合物手性配体交换固定相的制备及对DL-氨基酸的拆分

单分散亲水交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯树脂(PGMA/EDMA)和手性配体L-异亮氨酸反应,再与铜离子进行配位,得到一种新型的L-异亮氨酸聚合物键合高效手性配体交换固定相。在流动相为0.2 mol/L NaAc+0.1 mmol/L Cu(Ac)2水溶液和检测波长为254 nm条件下,固定相拆分了12种DL-氨基酸对映体,分离因子在1.23～2.33之间。详细考察了流动相pH、流速及柱温等色谱条件对DL-氨基酸对映体拆分的影响,并探讨了拆分过程热力学。结果表明,以单分散亲水性聚合物为基质的新型手性配体交换色谱固定相制备简单、操作方便、成本低廉,柱性能稳定。在配体交换模式下,固定相对12种DL-氨基酸对映体进行了良好的拆分。

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,利用基因重组技术替换ilv LXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv A和ilv IH,以期获得L-异亮氨酸生产菌。将ilv LXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilv LXGM后获得ILE01菌株,于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv IH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv A和ilv IH,获得菌株ILE02和ILE03,其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19 g/L。针对ILE03α-酮丁酸积累量过高的问题,通过改变操纵子中ilv A和ilv IH的顺序调节其转录水平,获得菌株ILE04,其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L。利用ILE04于5 L发酵罐中进行发酵实验,L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/(L·h)及4.6%。

纸层析-分光光度法测定发酵液中L-异亮氨酸

鉴于在菌种选育工作中必须准确测定菌株产酸水平,要求有可行的测定方法,对简单易行的纸层析 分光光度法测定发酵液中L 异亮氨酸质量进行了系统的研究,研究发现:选用合适的显色剂、层析溶剂及洗脱剂的同时选择最佳吸收波长、最佳洗脱时间及适宜的点样量,可以提高该测定方法的准确度和精密度,从而在菌种筛选过程中准确地测定发酵液中L 异亮氨酸质量.