表达细胞色素b562及分子改造L-氨基酸脱氨酶提高全细胞转化法合成丙酮酸效率

丙酮酸广泛用于制药、农业化学和化学工业。通过两种策略提高生物转化合成丙酮酸效率。首先,通过表达细胞色素b562提高黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成的效率,使反应时间由27 h减少到21 h,生产率提高了28.5%。其次,通过饱和突变技术对L-氨基酸脱氨酶(pm1)进行定向进化提高其催化能力,三突变体E418A/V438I/L278I催化合成丙酮酸产量为25.58 g/L,相比对照菌株提高了44.60%。结果表明,运用饱和突变技术和表达pm1伴侣蛋白(细胞色素b562)分别提高pm1催化能力与FAD合成效率能有效提高全细胞转化法合成丙酮酸的效率。

易错PCR法提高L-氨基酸脱氨酶全细胞转化L-异亮氨酸生产α-酮-β-甲基正戊酸效率

对奇异变形杆菌Proteus mirabilis中的L-氨基酸脱氨酶进行定向进化,利用易错PCR技术向基因中引入随机突变,建立突变文库来筛选可获得较高α-酮-β-甲基正戊酸产量的突变株。突变株7/23-6最适全细胞转化反应条件是以pH 8.5 Tris-HCl为缓冲液,用900 mmol/L L-异亮氨酸在30℃下进行催化反应21～24 h,其α-酮-β-甲基正戊酸产量可以达到102 g/L,底物转化率达到87%。与对照菌相比,α-酮-β-甲基正戊酸产量和底物转化率均提高了13%,热稳定性提高了36.7%。

L-氨基酸脱氨酶的分子改造及其用于全细胞催化法生产α-酮戊二酸条件的优化

酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)是谷氨酸脱氨基的酮酸产物,作为一种重要的有机酸广泛用于食品、医药、精细化工等领域。为提高L-氨基酸脱氨酶全细胞催化法合成α-KG的效率及产量,首先通过优化全细胞催化剂制备条件及全细胞转化反应条件,包括发酵过程中的温度、诱导剂浓度、诱导剂添加时刻、诱导时间等;全细胞转化过程中的温度、pH、细胞量、转化时间。各个条件优化后以200g/L谷氨酸钠为底物时,产量最终提高了54. 9%,摩尔转化率为39. 6%。其次,通过定点饱和突变对L-氨基酸脱氨酶进行定向进化以提高其催化能力。经过多次突变、筛选,最优突变体E. coli BL21-pET-20b(+)-pm1152催化200g/L谷氨酸钠生成α-KG最高产量为100. 9g/L,摩尔转化率为64. 7%,较最初对照菌株提高了66. 3%。结果表明,条件优化和饱和突变可有效提高重组大肠杆菌全细胞转化合成α-KG的能力。

以L-亮氨酸为底物一步法生物合成α-酮异己酸

α-酮异己酸是重要的有机合成和药物合成中间体,在食品、医药和化工行业中应用广泛。目前,α-酮异己酸的合成以化学法为主,需要高成本的催化剂或特殊的起始结构,导致α-酮异己酸生产成本较高。首次在食品安全性菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168中异源表达了普通变形杆菌(Proteus vulgaris)来源的L-氨基酸脱氨酶,以重组枯草芽孢杆菌作为全细胞催化剂、L-亮氨酸为底物实现了α-酮异己酸的一步法生物合成。其次,针对全细胞催化条件进行优化,最优条件(全细胞催化剂20 g/L、L-亮氨酸浓度100 mmol/L、反应温度45℃、pH 10.0、MgCl 2浓度5 mmol/L)下,转化24 h,可获得3.66 g/L的α-酮异己酸,且重复转化3次后,固定化细胞比游离细胞的再利用率提高了37.3%。该研究成功实现了以食品安全菌株B.subtilis 168为宿主一步法生物合成α-酮异己酸,为α-酮异己酸以及其他重要α-酮酸的工业化安全合成提供了新策略。

重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苯乳酸

L-苯乳酸是一种天然抑菌物质,对多种病原微生物有光谱抑制作用,有望成为一种新型生物防腐剂。通过构建多酶级联催化反应体系,提高大肠杆菌合成L-苯乳酸的能力。利用共表达L-氨基酸脱氨酶和苯丙酮酸还原酶并偶联葡萄糖脱氢酶进行辅酶再生,建立一种新型L-苯乳酸生物合成方法。各基因成功在大肠杆菌中表达,并对全细胞转化条件进行优化,最适转化条件为反应温度30℃,初始pH值为8.0,底物苯丙氨酸30 g/L,菌体OD_(600)为30,辅底物葡萄糖1倍摩尔当量,转化反应12 h,共生成L-苯乳酸21.39 g/L,摩尔转化率为71.33%。提供了一种简洁、高效的生物催化方法,为实现规模化生产奠定了基础。