谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌生物合成L-甲硫氨酸的代谢工程改造研究进展

L-甲硫氨酸是生命体必需的唯一含硫氨基酸,其作为前体参与合成多种生物活性物质,并参与机体多种代谢,被广泛应用于食品、动物饲料、药品、化妆品等领域。由于L-甲硫氨酸是唯一无法用微生物发酵法工业化生产的必需氨基酸,近年来,利用代谢工程提升L-甲硫氨酸产量受到国内外研究人员的普遍重视。本文主要分析并比较在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中L-甲硫氨酸的生物合成途径及代谢调控网络机制;分别从解除代谢途径对关键酶的反馈作用、阻断或削弱支路代谢途径、中心代谢调控网络的优化、增强辅助因子的供应以及转运系统的优化这5个方面综述L-甲硫氨酸代谢工程改造策略,总结L-甲硫氨酸的生物合成研究进展并作展望,旨在为L-甲硫氨酸高产发酵菌株的选择提供依据。

聚L-甲硫氨酸修饰电极的制备及对尿酸的测定

在pH9．5的磷酸盐缓冲溶液中，利用循环伏安（CV）法制备了聚工一甲硫氨酸修饰玻碳电极（PLMet／GC／CME）。研究了尿酸（UA）在该电极上的电化学行为，建立了伏安法测定UA的新方法。在pH5．0的磷酸缓冲溶液中，扫描速率为200mV／s，循环扫描电位在-0．3～1．0V时，UA在PLMet／GC／CME上产生一个灵敏的氧化峰，峰电位位于0．52V（眦Ag／AgCl）。用CV法、线性扫描伏安（LSV）法和示差脉冲伏安（DPV）法对UA进行测定，测定的线性范围分别为2．50×10^-6～1．00×10^-4mol／L、5．00×10^-6～1．00×10^-4mol／L和8．00×10^-7-1．00×10^-4mol/L；检出限分别为8．0×10^-7mol／L（CV、LSV法）和5．0×10^-7mol／L（DPV法）。用LSV法对尿样中的UA进行测定，结果满意。

鸟嘌呤在聚L-甲硫氨酸/石墨烯修饰电极上的电化学行为及测定

制备了聚L-甲硫氨酸/石墨烯修饰的玻碳电极,该电极在0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（p H 7.0）中对鸟嘌呤的氧化具有明显的电催化作用。采用循环伏安法（CV）考察了p H值、扫描速率对鸟嘌呤电化学行为的影响。利用示差脉冲伏安法（DPV）对鸟嘌呤进行测定,结果表明在3.6×10-7~4.0×10-5mol/L浓度范围内鸟嘌呤的氧化峰电流与其浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.990 4,检出限（S/N=3）为5.0×10-8mol/L。该修饰电极还具有较好的稳定性和重现性。

鲤肠道对L-甲硫氨酸和L-苯丙氨酸的离体吸收动力学

采用离体灌注试验系统和茚三酮对氨基酸显色的试验方法,定量分析了鲤肠道壁对氨基酸吸收和跨壁运输量,在相同的试验环境下,分别研究鲤肠道对L-甲硫氨酸和L-苯丙氨酸的吸收转运量。结果表明,在60 min内鲤肠道可对灌流液的氨基酸进行持续的吸收转运,并在肠道外积累;当肠道内灌流氨基酸浓度逐渐增加时,肠道外培养液中氨基酸的浓度与其起始浓度呈正相关变化,并未出现高浓度氨基酸对吸收转运的"抑制"效应;通过对吸收转运量达到最大值时试验氨基酸的浓度与吸收转运量的比较,以及氨基酸吸收转运量随时间的变化规律等的比较分析表明,鲤肠道能有效地吸收、运输L-甲硫氨酸和L-苯丙氨酸。鲤肠道对L-甲硫氨酸和L-苯丙氨酸的吸收曲线符合Michaelis-Menten方程。两种氨基酸的吸收动力学方程分别为:1/V=0.125 1×1/[S]+0.052 4(R2=0.978 1,P<0.05)和1/V=0.188 7×1/[S]+0.028 8(R2=0.976 2,P<0.05),动力学参数为:L-甲硫氨酸:Vmax=19.08μmol/(g.min),Kmax=2.39 mmol/L;L-苯丙氨酸:Vmax=34.72μmol/(g.min),Kmax=6.55 mmol/L。吸收动力学特征分析表明:鲤肠道对两种氨基酸的吸收是一种逆浓度、需要转运载体的主动吸收方式,且对不同的氨基酸有不同的吸收、运输特异性,鲤肠道对L-甲硫氨酸的吸收率和跨壁运输能力均强于L-苯丙氨酸(P<0.05)。

硫模块启动子对提高L-甲硫氨酸的生物合成的影响及发酵培养条件的优化

研究生物合成硫模块对L-甲硫氨酸产量的影响并优化了发酵条件。利用实验室构建的重组菌株,用trc启动子替换基因组上cysK的组成型启动子,在质粒pA*H上插入glpE和nrdH基因;通过构建PG3启动子文库,获得转录强度最高的p32启动子,进一步优化硫模块,最后通过对培养基的优化提高了硫代硫酸盐的供给,从而提高L-甲硫氨酸产量。结果表明:使用构建得到的E.coli W3110 JAHFEBL trc-cysK/pA*H-p32-nrdH-glpE菌株,发酵48 h后L-甲硫氨酸摇瓶水平产量达到1.3 g/L,较对照组提升了41.5%;通过对培养基的进一步优化,L-甲硫氨酸产量最终达到2.3 g/L,相比未优化的发酵水平提高了77.0%,且该研究为其他含硫氨基酸的生物合成提供了基础。

L-甲硫氨酸产生菌M0658原生质体形成及其再生条件的研究

以产L-甲硫氨酸芽孢杆菌M0658为出发菌株,考察了各种因素对原生质体形成和再生的影响.在原生质体形成和再生的最佳条件下,M0658原生质体形成率和再生率分别达到96.4%和75.3%,并在光学显微镜下观察了原生质体和原菌的形态差别.

银掺杂聚L-甲硫氨酸修饰电极测定6-巯基嘌呤

利用循环伏安法制备了银掺杂聚L-甲硫氨酸修饰玻碳电极（Ag—PLM／GCE），研究了6-巯基嘌呤在该修饰电极上的电化学行为，建立了循环伏安法测定6-巯基嘌呤的新方法。在pH6．5磷酸盐缓冲溶液中，扫描速率为140mV／s,6-巯基嘌呤在银掺杂聚L-甲硫氨酸修饰玻碳电极上出现一个氧化峰，峰电位为0．410V。用循环伏安法测定时，其峰电流与6-巯基嘌呤的浓度在3．00×10^-5——5．00×10^-3mol/L范围内呈现良好的线性关系，检出限为5．0×10^-6mol／L。用于乐疾宁片剂中6-巯基嘌呤含量的测定，结果满意。

Ag/聚L-甲硫氨酸复合修饰电极的制备及其用于果蔬中维生素C的测定

采用循环伏安法将Ag和L-甲硫氨酸（L-Met）聚合在玻碳电极表面,制得Ag/聚L-甲硫氨酸复合修饰电极（AgPLM/GCE）,并对维生素C在此电极上的电化学行为进行研究,建立测定维生素C的新方法。在pH 3.0的磷酸盐缓冲溶液中,扫描速率为220mV/s时,维生素C在修饰电极上,产生一灵敏的氧化峰,峰电位为0.326V（s Ag/AgCl）,峰电流与维生素C的浓度在2.00×10-4~3.00×10-2 mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为5.00×10-6 mol/L。用于部分水果蔬菜中维生素C的测定,结果满意。

铜掺杂聚L-甲硫氨酸修饰电极的制备及对对苯二酚的测定

利用循环伏安法，探究了铜和聚L-甲硫氨酸在玻碳电极表面电化学聚合的最佳条件。制备了铜掺杂聚L-甲硫氨酸修饰电极。同时研究了对苯二酚在Cu—PLM／GCE表面上的电化学行为，建立了方便实用的测定对苯二酚的方法。结果显示：在pH为3．5的磷酸缓冲溶液（PBS）中，以240mV／s的速率扫描，对苯二酚在修饰电极上产生一对灵敏的氧化还原峰，Epa=0．297V，Ek=0．220V。对苯二酚氧化峰电流与其浓度在8．0×10^-5-2．0×10^-3mol／L范围内呈良好的线性关系，检出限为8．0×10^-7mol／L。对对苯二酚样品的测定分析，结果满意。

聚L-甲硫氨酸/石墨烯修饰电极测定碘离子

利用循环伏安法制备了聚L-甲硫氨酸/石墨烯修饰电极(PLM/GO/GCE),探究了碘离子在修饰电极上的电化学性质,该电极对碘离子有良好的催化性能。在pH4.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,对碘离子进行测定的线性范围为2.50×10-6~2.50×10-3mol/L,检出限为8.0×10-7mol/L。该修饰电极具有良好的稳定性和选择性,用于样品中碘离子的测定,结果满意。

银掺杂聚L-甲硫氨酸修饰电极同时测定对苯二酚和邻苯二酚

用循环伏安法制备了银掺杂聚L-甲硫氨酸修饰玻碳电极,研究了对苯二酚和邻苯二酚在该修饰电极上的电化学行为,建立了同时测定对苯二酚和邻苯二酚的新方法。研究发现,在pH=5.0的磷酸盐缓冲溶液中,扫速为100 mV/s时,对苯二酚和邻苯二酚在银掺杂聚L-甲硫氨酸修饰玻碳电极上均出现1对氧化还原峰,峰电位分别为:Epa=0.228 V、Epc=0.162 V和Epa=0.347 V、Epc=0.287 V,二者的氧化峰电位差达119 mV,还原峰差达125 mV。在最佳的条件下,用差分脉冲伏安法同时测定邻苯二酚和对苯二酚的线性范围为3.00×10-6～1.00×10-4 mol/L,检出限为8.0×10-7 mol/L(对苯二酚)和5.0×10-7 mol/L(邻苯二酚)。此法用于废水样中对苯二酚和邻苯二酚的测定,获得满意结果。

L-甲硫氨酸高产菌株的紫外线诱变育种

以一株具有M 海因水解酶系统产L 甲硫氨酸 (L Met)的芽孢杆菌MV0 0 73为出发菌株 ,用含亮氨酸平板定向选育 ,经过 6轮紫外诱变 ,筛选出系列L Met高产突变株 ,其中菌株M60 4的L Met产量最高 在相同培养条件下 ,M60 4的L Met产量是出发菌株的 3 1 4倍 ,且L Met能以较高含量持续到发酵结束 M60 4连续传代 6次 ,遗传性状比较稳定 .

用亮氨酸抗性法选育L-甲硫氨酸高产突变株

用亮氨酸 (Leu)抗性为标记筛选L 甲硫氨酸 (L Met)高产突变株 .以一株具有M 海因水解酶系统的芽孢杆菌MV0 0 73为出发菌株 ,经过 6轮紫外诱变 ,筛选出 2 7株抗亮氨酸的L Met高产突变株 .其中突变株M6 0 4的L Met产量是出发菌株的 3倍 ,且培养液中积累的高含量L Met能在培养后期稳定持续 ,M6 0 4连续传代 6次 ,遗传性状稳定 ,表明用Leu抗性选育L Met高产突变株是一种切实可行的方法 .

L-甲硫氨酸修饰电极检测对氯苯酚

利用循环伏安法将L-甲硫氨酸修饰到裸玻碳电极表面,成功制备出聚L-甲硫氨酸修饰电极(PLM/GCE);分别采用循环伏安法和差分脉冲伏安法探讨修饰电极的电化学性能和对氯苯酚在该修饰电极上的电化学行为。结果发现,PLM/GCE在最优条件下,在8.0×10^(-6)~1.0×10^(-4)mol/L浓度范围内的氧化峰电流值与浓度呈现出较好的线性相关,线性方程为I_(p)=0.2441C+1.1296,r=0.9991。研究表明,PLM/GCE可用于对氯苯酚的电化学检测。

L-甲硫氨酸席夫碱及其锰(Ⅱ)配合物的合成、表征与抗癌活性

通过对氨基酸席夫碱合成方法的改进,合成了未见报导的4-OH-Sal-L-Met。K席夫碱及其锰(Ⅱ)配合物,并由元素分析、热重——差热分析、摩尔电导、红外光谱、氢核磁共振谱、电子光谱进行了表征。抗癌活性初步试验表明:锰(Ⅱ)配合物对艾氏腹水癌具有显著的抗癌活性,其抑制率达64.71%。

L-甲硫氨酸-壳聚糖分子印迹复合膜的制备与性能研究

采用本体聚合法,以壳聚糖(CTS)为基材,L-甲硫氨酸为印迹分子,聚乙二醇(PEG)2000、戊二醛为交联剂,制备了L-甲硫氨酸-戊二醛-聚乙二醇-壳聚糖分子印迹复合膜.实验结果表明:合成的L-甲硫氨酸-戊二醛-PEG-壳聚糖分子印迹复合膜的溶胀性和膜清水通量较好,对氨基酸的渗透量为0.130 mmol·cm-2和L,D-甲硫氨酸的分离因子为1.76.FT-IR、SEM、XRD和TGA表征分析显示:分子印迹膜表面平整、微观结构规整紧密,具有较低的结晶度和高热稳定性.

摩尔比对L-赖氨酸/L-甲硫氨酸与L-抗坏血酸Maillard反应产物抗氧化活性的影响

在L-赖氨酸/L-甲硫氨酸与L-抗坏血酸(Lys/Met ASA)的模式体系中,研究了反应物摩尔比对Maillard反应产物(MRPs)的抗氧化活性的影响。控制反应物不同摩尔比(Lys/Met与ASA的物质的量之比分别为0∶0.002、1∶5、1∶3、1∶1和3∶1),在140℃下加热搅拌制得MRPs,以还原力和1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼自由基(DPPH·)的清除能力为指标,对其产物抗氧化活性进行分析评价。结果表明:在Lys/Met-ASA体系中摩尔比分别为1∶3和1∶5时,产物的还原力、DPPH自由基的清除能力最大;摩尔比对MRPs的抗氧化活性有着显著的影响。

流动注射化学发光抑制法测定水样中L-甲硫氨酸的含量

在碱性条件下,过氧化氢氧化鲁米诺产生化学发光,本文系统讨论了L-甲硫氨酸对Luminol-H2O2-CTAB化学发光体系的影响,发现在一定条件下,L-甲硫氨酸对Luminol-H2O2-CTAB化学发光体系有较强的抑制作用。据此建立了流动注射化学发光法测定L-甲硫氨酸的分析方法。该法简单、快速、灵敏度高。测定L-甲硫氨酸的线性范围为1.0×10-7～5.0×10-5mol/L,检出限为7.8×10-8mol/L。对1.0×10-5mol/l的L-甲硫氨酸进行9次平行测定,得该法的相对标准偏差为3.2%。成功地用于水样中L-甲硫氨酸的测定,结果满意。

重组大肠杆菌合成L-甲硫氨酸的发酵过程优化

L-甲硫氨酸作为唯一含有硫元素的必需氨基酸,在生物体内具有非常重要的生理和生化功能,而微生物发酵法合成L-甲硫氨酸因其发酵水平较低仍未达到工业化生产要求。本文在实验室前期构建的L-甲硫氨酸高产菌株大肠杆菌(Escherichia coli)W3110ΔIJAHFEBC trc-fliY trc-malY/PAM glyA-22 metF的基础上系统优化了其发酵过程,在优化初始葡萄糖浓度的基础上,比较了DO-Stat、pH-Stat、控残糖浓度和恒速补料等不同补料工艺对L-甲硫氨酸发酵生产的影响,发现葡萄糖的控制对发酵过程有较大影响。在上述研究的基础上,进一步开发了最优的分批补料发酵工艺,使L-甲硫氨酸发酵产量提高到31.71 g/L,发酵时间缩短为68 h,是目前报道的最高产量。同时,建立了最优分批补料工艺下的发酵动力学模型,较好地拟合了L-甲硫氨酸发酵生产过程,为L-甲硫氨酸的发酵法生产提供了一定的数据参考。

代谢工程改造大肠杆菌一碳模块高效合成L-甲硫氨酸

L-甲硫氨酸又名L-蛋氨酸,是人体必需8种氨基酸之一,在饲料、医药、食品领域具有重要应用。以实验室前期构建的M2(Escherichia coli W3110?IJAHFEBC/PAM)为出发菌株,以模块化代谢工程策略构建了一株L-甲硫氨酸高产菌株。首先通过过表达亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MetF)和筛选不同来源的丝氨酸羟甲基转移酶(hydroxymethyltransferase,GlyA),增强了一碳模块甲基供体的生成,优化了一碳模块。随后针对一碳模块的前体供应,过表达了胱醚裂解酶(cysteamine lyase,MalY)和半胱氨酸内运基因(fliY),有效地提高了L-高半胱氨酸和L-半胱氨酸的供应。最终摇瓶发酵L-甲硫氨酸的产量由2.8 g/L提高至4.05 g/L,5 L发酵罐中达到18.26 g/L。研究结果表明,一碳模块对L-甲硫氨酸的生物合成具有十分重要的影响,在细胞内通过优化一碳模块,可以实现L-甲硫氨酸的高效生物合成。本研究为进一步提高微生物发酵生产L-甲硫氨酸的水平奠定了基础。