L-脯氨酸-4-羟化酶的异源表达和合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的条件优化

L-脯氨酸-4-羟化酶(L-Proline-4-hydroxylase,P4H)是依赖α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+的双加氧酶成员之一,在反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline,t-4Hyp)等重要手性化合物的生物合成中发挥关键作用。本研究构建了来源于Bradyrhizobium japonicum USDA 6的P4H重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/p ET-28b-p4h BJ,SDS-PAGE和酶活检测结果表明,该菌株具有表达可溶性P4H和催化合成t-4Hyp的能力。通过优化,确定了该重组菌全细胞催化合成t-4Hyp较优的反应体系和条件:10 m L p H 6.5 80 mmol/LMES缓冲液、9 mmol/L L-Pro,6 mmol/L L-抗坏血酸,6 mmol/Lα-KG,0.8 mmol/L Fe SO4·7H2O,反应温度为35℃;在20 g/L湿细胞的催化反应中,t-4Hyp的合成量达到34.86 mg/L,比优化前(17.53 mg/L)提高了98.86%。该工作为进一步利用P4H生物催化法合成t-4Hyp奠定了一定的技术基础。

定点饱和突变提高L-脯氨酸-4-羟化酶的酶活

为了提高L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)合成反式-4-羟基-L-脯氨酸(4-Hyp)的能力,首先对实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4h的P4H进行三维结构模拟和"热点"氨基酸分析,选择了7个位于"疏水口袋"附近的氨基酸残基(Y205,K207I241,F137,T142,V53和R45)进行定点饱和突变,得到P4H酶活力明显提高的突变型酶F137R和Y205K。采用F137R和Y205K催化转化0.35g/L L-脯氨酸产物4(Hyp质量浓度分别为55.09mg/L和52.29mg/L),比野生型酶分别提高了58%和50%。经过分子对接比较发现,突变型P4H的活性中心没有发生显著变化,酶活的提高可能是由于突变作用使蛋白构型发生了轻微改变,增加了该酶与底物或辅底物的亲和力引起的。该结果为进一步利用P4H生物合成4-Hyp提供了重要的理论基础。

脯氨酰-4-羟化酶1及CD44在卵巢高级别浆液性癌中的表达及意义

目的 检测脯氨酰-4-羟化酶1(P4HA1)和CD44在卵巢高级别浆液性癌中的表达情况并分析其与卵巢高级别浆液性癌临床病理特征的关系。方法 本研究为回顾性分析。选取2020年6月至2022年6月首都医科大学附属北京妇产医院收治的经病理学检查诊断为卵巢高级别浆液性癌的34例患者作为观察组,另选择同期医院诊断为卵巢良性浆液性肿瘤(卵巢浆液性囊腺瘤)的20例患者作为对照组。采用免疫组织化学法检测两组肿瘤组织中P4HA1及CD44的表达情况,分析其与卵巢高级别浆液性癌临床病理特征的关系,并分析P4HA1与CD44的表达有无相关性。结果 观察组患者年龄、肿瘤直径、P4HA1阳性率及CD44阳性率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与P4HA1表达阴性的卵巢高级别浆液性癌患者相比,P4HA1表达阳性的卵巢高级别浆液性癌患者中腹腔冲洗液/腹水细胞学检查阳性比例更高,差异有统计学意义(P<0.05)。与CD44表达阴性的卵巢高级别浆液性癌患者相比,CD44表达阳性的卵巢高级别浆液性癌患者中网膜/腹膜、腹腔冲洗液/腹水细胞学检查阳性比例更高,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关系数分析显示,在卵巢高级别浆液性癌中,P4HA1与CD44的表达呈正相关(r=0.539,P<0.001)。结论 P4HA1及CD44在卵巢高级别浆液性癌肿瘤组织内呈高表达,且与网膜/腹膜、腹腔冲洗液/腹水细胞学检查阳性有关。

血清L-Arg和IL-4水平预测症状性颈动脉狭窄患者再发缺血性脑卒中的价值

目的探讨血清L-精氨酸(L-Arg)和白细胞介素(IL)4水平预测症状性颈动脉狭窄患者再发缺血性脑卒中(IS)的价值。方法选取2018年7月—2021年7月西安交通大学第一附属医院、咸阳市第一人民医院和延安大学咸阳医院症状性颈动脉狭窄患者196例。收集所有患者的临床资料,采用多普勒超声检查颈动脉狭窄程度、颈动脉斑块性状和斑块新生血管密度相关参数[基线强度、峰值强度和时间-强度曲线的曲线下面积(AUCTC)],并检测血清L-Arg和IL-4水平。对所有患者随访12个月,根据是否再发IS分为再发组(35例)和未再发组(161例)。采用Logistic回归分析评估症状性颈动脉狭窄患者再发IS的危险因素。采用Pearson相关分析评估各项指标之间的相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价L-Arg和IL-4水平判断症状性颈动脉狭窄患者再发IS的效能。结果再发组峰值强度、AUCTC、颈动脉狭窄率高于未再发组(P<0.001),血清L-Arg和IL-4水平均低于未再发组(P<0.05)。血清L-Arg和IL-4水平与峰值强度、AUCTC和颈动脉狭窄率均呈负相关(P<0.05)。L-Arg降低、IL-4降低、峰值强度增加、AUCTC增加、颈动脉重度狭窄、高血脂和易损斑块均是症状性颈动脉狭窄患者再发IS的独立危险因素(P<0.05)。血清L-Arg、IL-4单项检测和联合检测判断症状性颈动脉狭窄患者再发IS的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.803、0.760、0.845。根据L-Arg和IL-4的最佳临界值将所有患者分别分为降低组和未降低组。L-Arg降低组和IL-4降低组易损斑块所占比例分别高于L-Arg未降低组和IL-4未降低组(P<0.001)。结论低水平L-Arg和IL-4与症状性颈动脉狭窄患者再发IS有关,或可作为IS再发的预测指标。

反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因密码子优化及表达

L-羟脯氨酸用途非常广泛,具有较好的应用价值,利用反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶能将L-脯氨酸通过生物转化法生成反式-4-羟基-L-脯氨酸.对指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因密码子优化及蛋白可溶性表达条件进行了探索.基因p4hy的GC摩尔百分含量由73.63降至61.45;在23℃下,加入1mmol/L IPTG及分子伴侣pG-KJE8后可溶性蛋白的含量明显增多;密码子优化后的酶蛋白P4HY具有较好的催化生产羟脯氨酸的能力,反应40h后转化率达到72.8%.

抑制脯氨酸羟化酶-2对胰腺癌吉西他滨化疗敏感性及肿瘤转移的影响

目的探究抑制脯氨酸羟化酶结构域(PHD)2对胰腺癌化疗敏感性与肿瘤转移的影响。方法将SW1990细胞随机分为对照组、sh-NC组和sh-PHD2组,分别使用shRNA-NC与shRNA-PHD2慢病毒感染sh-NC组和sh-PHD2组细胞,对照组细胞不进行处理,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western印迹检测转染效果;细胞划痕实验和Transwell小室实验检测细胞迁移与侵袭能力,免疫荧光染色检测细胞上皮-间质转化能力,细胞计数试剂盒(CCK)-8检测吉西他滨处理下的细胞存活率。将45只裸鼠随机分为3组,每组15只,通过接种转染后的SW1990细胞构建移植瘤模型,分组包括sh-NC组、sh-NC+吉西他滨组和sh-PHD2+吉西他滨组,治疗8 w后,计算肿瘤组织体积、重量及肝转移情况,苏木素-伊红(HE)染色观察肿瘤组织病理学改变,免疫组织化学染色检测肿瘤组织Ki-67表达,TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡。结果shRNA-PHD2慢病毒感染SW1990细胞后,与对照组比较,sh-PHD2组PHD2 mRNA与蛋白表达水平显著下降(P<0.05),细胞划痕愈合率显著减小,细胞迁移与侵袭数目显著减少(P<0.01),E-钙黏蛋白(cadherin)荧光表达强度增强,波形蛋白(Vimentin)荧光表达强度减弱,吉西他滨处理下的细胞存活率显著降低(P<0.01);与sh-NC组比较,sh-NC+吉西他滨组肿瘤体积与重量均显著减小,出现肝转移比例减小,肿瘤组织内Ki-67阳性率显著降低,TUNEL阳性细胞比例显著增加(P<0.01);而sh-PHD2+吉西他滨组的肿瘤体积与重量较sh-NC+吉西他滨组均显著减小,肝转移比例更少,同时,肿瘤组织内Ki-67阳性率显著降低而TUNEL阳性细胞比例显著增加(P<0.01)。结论抑制PHD2表达可在体内与体外降低胰腺癌肿瘤细胞的转移能力,并增强肿瘤细胞对吉他西滨的化疗敏感性。

脯氨酰-4-羟化酶亚基α-2通过肌醇需要酶1α介导的UPR信号通路调控肝癌细胞凋亡并预测早期肝细胞癌的不良预后

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)严重危害着人类健康。尽管大量研究表明,在HCC早期进行手术切除可提高患者的生存率,但其高复发率仍然阻碍着治疗进程。本研究分析蛋白质组学数据发现。脯氨酰-4-羟化酶亚基α-2(prolyl 4-hydroxylase subunit α-2,P4HA2)在早期HCC组织中高表达,Kaplan-Meier曲线、Cox比例风险回归模型(cox regression model)证明,P4HA2高表达的早期肝癌患者预后较差,且P4HA2可作为患者预后的独立预测因子。通过敲低或过表达实验发现,P4HA2明显促进肿瘤细胞的增殖、迁移等恶性生物学行为。敲低P4HA2激活了由肌醇需要酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)介导的促凋亡非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。以上结果表明,P4HA2可能通过调节内质网稳态来调控肝癌细胞凋亡,P4HA2有望成为HCC潜在的治疗靶点。

脯氨酰4-羟化酶α亚单位3在胃癌中的表达及临床意义

目的 探讨脯氨酰4-羟化酶α亚单位3(P4HA3)在胃癌中的表达及临床意义。方法 通过UALCAN数据库及基因表达综合(GEO)数据库分析胃癌组织和癌旁正常组织中P4HA3基因表达差异,并进一步分析癌症基因组图谱(TCGA)数据库中不同临床分期、分化程度、年龄和性别胃癌患者P4HA3基因表达差异。以P4HA3基因表达中位值为界,将患者分为P4HA3高表达组和P4HA3低表达组,采用Kaplan-Meier plotter在线数据库比较两组患者的总生存时间、首次进展生存时间和进展后生存时间。收集107例胃癌患者的胃癌组织及癌旁正常组织标本,采用免疫组织化学染色法检测P4HA3蛋白表达情况,并结合临床特征及随访资料进行综合分析。结果 TCGA数据库和GEO数据库中的数据均显示,胃癌组织中P4HA3基因表达水平明显高于癌旁正常组织(P﹤0.01)。TCGA数据库显示,不同年龄、分化程度、临床分期胃癌患者的P4HA3基因表达水平比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。Kaplan-Meier plotter在线数据库分析发现,P4HA3高表达组患者的中位总生存时间、中位首次进展生存时间、中位进展后生存时间均明显短于P4HA3低表达组,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。胃癌组织中P4HA3蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织(P﹤0.05)。不同肿瘤直径、分化程度、TNM分期、T分期胃癌患者胃癌组织中P4HA3蛋白表达情况比较,差异均有统计学意义(P﹤0.05);P4HA3阴性表达患者的累积生存率明显高于P4HA3阳性表达患者(P﹤0.01)。结论 P4HA3在胃癌组织中高表达,且与胃癌的发生发展及预后有关,可能成为胃癌的预后评估指标和潜在治疗靶点。

缺氧诱导因子-1α及脯氨酸羟化酶2在子宫内膜腺癌中的表达意义

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及脯氨酸羟化酶2(PHD2)在子宫内膜腺癌中的表达意义。方法选取2019年7月至2020年6月丹东市中心医院收治的40例子宫内膜腺癌患者作为子宫内膜腺癌组,选取同期40例增殖期子宫内膜患者作为增殖期内膜组,另选取同期40例不典型增生子宫内膜患者作为不典型增生组。3组均使用免疫组化链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法检测HIF-1α、PHD2,比较3组HIF-1α、PHD2表达,分析子宫内膜腺癌病理特征与HIF-1α、PHD2阳性表达情况。结果3组HIF-1α、PHD2阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)。子宫内膜腺癌组HIF-1α阳性率高于不典型增生组、增殖期内膜组,且不典型增生组高于增殖期内膜组,差异有统计学意义(P<0.05);子宫内膜腺癌组PHD2阳性率低于不典型增生组、增殖期内膜组,且不典型增生组低于增殖期内膜组,差异有统计学意义(P<0.05)。子宫内膜腺癌患者HIF-1α、PHD2的组织学分级、临床分期、肌层浸润、淋巴结转移占比比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α和PHD2表达异常会影响子宫内膜腺癌患者的肌层侵润、组织学分级、临床分期,因此,在子宫内膜腺癌疾病检查、诊断和治疗具有重要意义,能为子宫内膜腺癌的诊治提供可靠依据。

L-脯氨酸拆分1,1′-联-2-萘酚的实验设计

为了将手性化合物的包结拆分法引入有机化学实验教学,设计了有机化学综合实验“L-脯氨酸拆分1,1′-联-2-萘酚”:将L-脯氨酸和外消旋联萘酚研磨后,乙腈回流后析出L-脯氨酸和(S)-BINOL形成的包合物,(R)-BINOL留在溶液中。该综合实验实现了光学纯联萘酚的高效拆分,创新了教学体系。实践表明,该综合实验采用基于非共价键作用的包结拆分法进行手性拆分,激发了学生的学习兴趣;此外,该实验综合性强,有利于学生动手操作能力、分析和解决综合问题能力的培养。

生物转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的定量分析方法

以芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）为柱前衍生剂，四硼酸钠为缓冲溶液，建立了一种柱前衍生反相高效液相色谱（RP-HPLC）测定微生物转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的定量分析方法。优化了衍生反应条件，当衍生反应体系中水和乙腈的比例为66∶34，pH值为9.9时衍生效果最佳。采用Agilent Extend C-18柱进行分离，以0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈作为流动相，梯度洗脱，检测波长263 nm。L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸均在0.01~500 mg/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为5.00~7.00 ng/L，不同浓度下的平均回收率分别为98.9%~102%和97.9%~100%。该方法重现性好，精密度高，为定量分析微生物发酵液中的L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸提供了有效方法。

(4S)-1-芴甲氧羰基-4-叠氮基-L-脯氨酸的合成

目的合成用于caspofungin类似物全合成的关键中间体——— (4S) 1 芴甲氧羰基 4 叠氮基 L 脯氨酸。方法以 (4R) 1 叔丁氧羰基 4 羟基 L 脯氨酸乙酯 (2 )为原料 ,经羟基甲磺酰化、叠氮基取代、酯水解、氨基脱叔丁氧羰基保护及 9 芴甲氧羰基再保护合成了关键氨基酸中间体 (4S) 1 芴甲氧羰基 4 叠氮基 L 脯氨酸 ,通过质谱 (MS)和氢谱 (1H NMR)确证其结构。结果该工艺反应条件温和、操作简便、收率高 ,总收率达 6 2 3%。

反义寡脱氧核苷酸对脯氨酰4-羟化酶mRNA表达的抑制作用

目的：观察反义寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）对脯氨酰４－羟化酶（Ｐ４Ｈ）两种亚基ｍ ＲＮＡ 表达的影响。方法：采用定量ＲＴ－ＰＣＲ技术检测培养的人皮肤成纤维细胞中Ｐ４Ｈ ｍ ＲＮＡ的相对含量。结果：不同浓度（０．１，０．２，０．５，１．０ μｍ ｏｌ／Ｌ）反义ＯＤＮ处理组，人皮肤成纤维细胞中Ｐ４Ｈ ｍ ＲＮＡ表达水平均显著低于对照组及错配ＯＤＮ 处理组；其中０．１，０．２ μｍ ｏｌ／Ｌ反义ＯＤＮ作用２０ ｈ 时，抑制效应达到最大，５０～７０ ｈ 后，逐渐恢复到对照组水平。正义ＯＤＮ与错配ＯＤＮ对Ｐ４Ｈ ｍ ＲＮＡ表达则无明显抑制作用。结论：反义ＯＤＮ 对Ｐ４Ｈ 两种亚基的ｍ ＲＮＡ表达均有显著和特异的抑制作用。

反相液相色谱法测定(反)-4-环已基-L-脯氨酸和(反)-4-苯基-L-脯氨酸

采用反相高效液相色谱法分离和测定（反）-4-环已基-L-脯氨酸和（反）-4-苯基-L-脯氨酸．在选定的色谱条件下，（反）-4-环已基-L-脯氨酸、（反）-4-苯基-L-脯氨酸和杂质之间具有较好的分离效果．该方法具有操作简单、快速、准确度和精密度较好，对同一（反）-4-环已基-L-脯氨酸试样多次测定，（反）-4-环已基-L-脯氨酸的日内、日间相对标准偏差（RSD）分别1．55％和0．09％；（反）-4-苯基-L-脯氨酸的日内、日间相对标准偏差（RSD）分别1．94％和1．79％.（反）-4-环已基-L-脯氨酸和（反）-4-苯基-L-脯氨酸的回收率分别为99．80％～100．40％和97．28％～100．00％．

L-脯氨酸催化合成1,4-二氢吡啶和1,8-二氧代十氢吖啶

含1,4-二氢吡啶和1,8-二氧代十氢吖啶分子片段的化合物具有扩张血管、抗菌和抗肿瘤等活性。因此,探讨该类衍生物绿色合成方法成为药物合成领域的热点之一。基于有机小分子催化剂L-脯氨酸廉价易得、无毒无害和水溶性等特点,结合微波辐射技术快速高效等优势,以芳香醛、β-二酮(乙酰乙酸乙酯/二甲基环己二酮)和乙酸铵为原料,乙醇为溶剂,催化剂用量20 mol/mol,微波功率300 W和80℃的条件下,通过成环缩合反应“一锅法”合成了目标化合物,收率达80%~93%。该方法具有条件温和、操作简单以及环境友好等优点。

超声辅助L-脯氨酸催化合成2,6-二芳基-3,4′-联吡啶

以L-脯氨酸为绿色催化剂,烟醛或2-氯烟醛、取代苯乙酮及乙酸铵为原料,超声波辅助下就一锅法的成环缩合反应进行研究;实验结果表明,乙醇为溶剂,催化剂L-脯氨酸摩尔分数为15%,超声波工作频率40 kHz温度60℃下反应20 min左右,即可得到2,6-二芳基-3,4′-联吡啶化合物4a~4j,收率为78%~90%,其结构经IR、^(1)H NMR和元素分析等表征。该方法具有条件温和、操作简单以及环境友好等优点。

乳腺癌前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平与前哨淋巴结转移的关系及意义

目的探讨乳腺癌前哨淋巴结中八聚体结合转录因子-4(Oct-4)、血管内皮生长因子-D(VEGF-D)、L-选择素(L-selectin)水平与前哨淋巴结转移(SLNM)的关系及意义。方法选取2020年4月—2022年7月收治的147例乳腺癌,根据SLNM情况分为SLNM组67例、无SLNM组80例,比较2组及不同T分期、区域淋巴结分期患者前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平,采用多因素Logistic回归分析寻找乳腺癌SLNM的危险因素,采用决策曲线分析(DCA)和临床影响曲线(CIC)分析前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin评估SLNM的临床效用和与实际情况的符合度。结果SLNM组前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平高于无SLNM组(P<0.01)。随着T分期和区域淋巴结分期升高,前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin均是乳腺癌患者SLNM的独立危险因素(P<0.01);绘制DCA曲线显示,前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin评估乳腺癌患者SLNM均有正向的净获益,临床效用排序:Oct-4、L-selectin、VEGF-D,三者联合较单独指标评估的临床获益度均明显升高;绘制CIC显示,阈概率值>0.6时,三者联合评估SLNM与实际情况具有较高的符合率。结论乳腺癌前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平与SLNM及肿瘤分期有关,是患者发生SLNM的一个潜在机制,三者联合评估SLNM具有良好的临床获益度,可作为评估乳腺癌患者SLNM的可靠方法。

1株产顺式-4-羟基-L-脯氨酸基因工程菌的构建及发酵初步优化

顺式-4-羟基-L-脯氨酸是一种可用于合成多种药物和香料的手性结构物质。通过对L-脯氨酸顺式-4-羟化酶基因的优化设计,并引入色氨酸串联启动子,构建出1株能表达L-脯氨酸顺式-4-羟化酶的重组大肠杆菌JM109/p EHC4,从而可以将游离的L-脯氨酸转化为顺式-4-羟基-L-脯氨酸。对该菌株进行摇瓶发酵优化,得出优选培养基为(g/L):葡萄糖10,甘油10,蛋白胨10,NaCl 6,FeSO_4·7H_2O 0.278,L-抗坏血酸0.528,(NH_4)_2SO_45,K_2HPO41,MgSO_40.2,CaCl_20.015,L-脯氨酸4。在该条件下发酵12 h,顺式-4-羟基-L-脯氨酸的产量达到657.08mg/L,比优化前提高了3.76倍;在24 h时产量达到1 582.75 mg/L。研究结果为顺式-4-羟基-L-脯氨酸的微生物转化法生产提供了基础。

putA与vgb基因对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响

反式-4-羟基-L-脯氨酸是在自然界中分布最广泛的一种羟脯氨酸,在医药、化工、食品和美容业等领域有广泛应用。为了在生物转化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的过程中减少菌体对底物脯氨酸的降解,利用Red/ET同源重组系统敲除putA基因,并比较野生型菌株与缺失型菌株在不同培养基中的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量,再引入vgb基因,考察该基因对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响。结果表明:putA基因的缺失能阻止菌体降解脯氨酸;碳源充足的情况下,GC培养基更有利于反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产;putA基因缺失型菌株能将被消耗的脯氨酸全部转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸;vgb基因的存在能显著提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。