解木糖赖氨酸芽孢杆菌发酵和生物催化产生L-2-氨基己二酸

以解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2为出发菌株,110 mmol/L L-赖氨酸单盐酸盐为发酵前体,144 h发酵后L-2-氨基己二酸浓度达到10.4 mmol/L,产率为9.5%.以解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2全细胞为生物催化剂,利用共生的L-赖氨酸6-脱氢酶和?-1-哌啶啉-6-羧酸脱氢酶催化L-赖氨酸单盐酸盐转化为L-2-氨基己二酸.最优条件为:细胞浓度为45 g(干重)/L,L-赖氨酸单盐酸盐浓度为100 mmol/L,pH=7.0,温度为30℃,反应时间144 h.在最优条件下,从100 mmol/L L-赖氨酸单盐酸盐产生90 mmol/L L-2-氨基己二酸,产率为90%.我们推测了生物催化过程中L-2-氨基己二酸产生的反应机理.

L-酪氨酸对大鼠黄体细胞3β-羟-甾体脱氢酶活性的影响

目的 :研究L 酪氨酸对离体培养大鼠黄体细胞 3β HSD活性的影响。 方法 :运用细胞培养技术和放射免疫分析法 ,观察不同剂量L 酪氨酸对大鼠黄体细胞 3β HSD活性的影响和L 酪氨酸及其类似物酪氨酰肼在拮抗hCG诱导孕酮生成作用中 ,3β HSD活性的变化。 结果 :① 0 .2mmol-1和 2 .0mmol-1的L 酪氨酸明显抑制 3β HSD的活性 ,相同浓度的L 苯丙氨酸及L 多巴胺对此酶活性无影响 ;②在底物浓度较低时 ,L 酪氨酸可显著增强 3β HSD活性 ,随着底物浓度的增加 ,L 酪氨酸的作用逐渐减弱并转为抑制作用。③L 酪氨酸及酪氨酰肼对hCG诱导的 3β HSD活性有明显的抑制作用。结论 :L 酪氨酸可明显影响大鼠黄体细胞 3β HSD活性 ,其作用性质与底物浓度密切相关。L 酪氨酸及酪氨酰肼抑制hCG诱导的 3β HSD活性。

加强表达3-磷酸甘油醛脱氢酶对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中,由3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)催化的反应是糖酵解途径的限速步骤,该反应还直接影响了L-丝氨酸的前体3-磷酸甘油酸的合成。研究首先比较了产L-丝氨酸的野生型菌株C.glutamicum SYPS-062与模式菌株C.glutamicum ATCC14067的GAPDH酶活力,发现SYPS-062的GAPDH酶活力比ATCC14067高了55.8%。进一步采用在C.glutamicum33a△SS基因组上增加gap A拷贝数的方法加强表达GAPDH,构建了重组菌C.glutamicum33a△SS-2gap A。重组菌GAPDH转录水平和酶活力分别提高119%和53%,最大比生长速率提高10.6%,总糖耗速率提高4.4%,L-丝氨酸产量提高17.4%,糖酸转化率提高12.2%,生产强度提高17.4%。结果表明,加强表达GAPDH能够提高重组菌的生长和糖耗速率,并能够提高L-丝氨酸的产量、糖酸转化率和生产强度。

3-磷酸甘油醛脱氢酶促进谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸

在谷氨酸棒状杆菌( Corynebacterium glutamicum )SNK118中表达NADP +依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因,提高胞内NADPH水平,以提高 L -精氨酸( L -Arginine)和 L -鸟氨酸(L-Ornithine)发酵产量。通过NCBI数据库检索,选取了3个不同来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因。经测定酶活力,最终选择糖丁基梭菌( Clostridium saccharobutylicum) DSM13864来源的NADP +依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因( CsgapC )。构建了产 L -精氨酸的重组菌SNK118/pXMJ19- CsgapC,当摇瓶发酵70 h时产 L -精氨酸11.55 g/L,糖酸转化率0.13 g/g,与对照菌SNK118/pXMJ19相比,精氨酸产量和糖酸转化率分别提高了26%和10.2%。在 L -鸟氨酸生产菌株SNK118Δ argF Δ argR 中重组表达 CsgapC,重组菌SNK118Δ argF Δ argR /pXMJ19- CsgapC 摇瓶发酵70 h产 L -鸟氨酸27.76 g/L,糖酸转化率0.274 g/g,与对照菌SNK118Δ argF Δ argR /pXMJ19相比, L -鸟氨酸产量和糖酸转化率分别提高了20.1%和15.6%。结果表明,异源表达 CsgapC 有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵生产 L -精氨酸和 L -鸟氨酸的水平。

亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶共表达菌株发酵产酶条件优化及其在L-2-氨基丁酸合成中的应用

亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸生成L-2-氨基丁酸需要辅酶NADH参与,构建 Escherichia coli (LeuDH/FDH),通过共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶实现了辅酶NADH胞内循环再生。通过产酶条件优化,提高该菌株催化制备L-2-氨基丁酸的效率。结果表明,在5L发酵罐上,在诱导温度为22 ℃、诱导剂乳糖质量浓度为 8.0 g/L 和诱导时间为17 h的条件下,亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶活分别达到79.2 U/g和216.1 U/g,催化效果最佳。利用该菌株全细胞为催化剂,耦合苏氨酸脱氨酶,在1L反应体系中进行了催化反应, L -苏氨酸质量浓度为180 g/L时,无需额外添加辅酶,8 h反应后底物转化率达到99%,L-2-氨基丁酸 e.e.值99.5%以上,时空产率19.3 g/(L·h)。该研究为建立高效、低成本的L-2-氨基丁酸工业化生产方法提供了基础。

赖氨酸6-氨基转移酶产生菌株的筛选鉴定

以赖氨酸为唯一氮源,从土壤中分离到36株能够利用赖氨酸的菌株,从中筛选到2株具有赖氨酸6-氨基转移酶活力的菌株。并对酶活较高的菌株进行形态以及ITS序列鉴定,菌株2-14鉴定为轮枝霉菌(Ver-ticilliumsp.)。该菌株能将L-赖氨酸代谢转化为L-哌可酸,并且其中几乎不含有D-哌可酸。该研究为国内L-哌可酸生物合成提供了有价值的资料。

赖氨酸6-氨基转移酶合成条件的优化

以一株从土壤中分离、筛选到轮枝霉菌(Verticillium sp.)2-14为起始菌株,在摇瓶发酵水平上对其产赖氨酸6-氨基转移酶的条件,包括不同碳源、氮源、磷酸盐、表面活性剂等进行了优化,并对基本无机盐离子进行了正交实验分析.结果表明,该菌株产LAT最佳液体发酵培养基为:0·2%L-赖氨酸,3%可溶性淀粉,0·5%KH2PO4,0·1%MgSO4·7H2O.通过考察菌株生长与产酶进程发现,培养52h时酶活达到峰值1217U·L-1,与优化前相比,酶活力提高一倍.

亮氨酸脱氢酶催化底物偶联法合成α-酮异己酸

构建了亮氨酸脱氢酶(LeuDH)催化的底物偶联反应体系,打破氧化脱氨反应平衡,同时制得高附加值的α-酮异己酸(α-KIC)和L-2-氨基丁酸,并实现辅酶NAD^+的高效循环再生.基于LeuDH的底物专一性和催化动力学参数,考察了不同酮酸底物对于底物偶联反应效率的影响,选择转化率最高的2-丁酮酸作为偶联底物,使α-KIC产率由单步氧化反应的2. 75%提高至66. 82%.通过考察底物浓度、pH值、NH_4^+浓度和辅酶NAD^+浓度等反应条件对偶联反应效率的影响,使α-KIC产率进一步提高至83. 25%,同时辅酶NAD^+的总转化数(TTN)达到5. 88×105.通过改变底物L-亮氨酸和2-丁酮酸的摩尔比,能够将α-KIC的产率进一步提高至92. 74%.

吐温-80对钝齿棒杆菌产L-赖氨酸的影响

对吐温-80提高L-赖氨酸产量的分子机制进行探究。以钝齿棒杆菌MT-M4Δpro B为出发菌株,在菌株生长至对数初期36 h时,添加5 mg/m L吐温-80进行摇瓶发酵,通过反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse translate?real-time?fluorescence?quantitative?polymerase?chain?reaction,RT-q PCR)监控相关基因的转录水平、胞内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form,NADPH)水平及α-酮戊二酸脱氢酶复合物(α-oxoglutarate dehydrogenase complex,ODHC)的活力。摇瓶发酵结果表明,添加吐温-80使L-赖氨酸产量提高了215%;RT-q PCR结果表明,编码ODHC的基因odh A、suc B和lpd A、参与ODHC调控的基因pkn G、dts R和ppp以及合成NADPH的磷酸戊糖途径基因zwf的转录水平均发生了变化,其中odh A、suc B、lpd A、pkn G及dts R1基因分别发生了上调,ppp基因下调,相应ODHC活力提高了32.9%;zwf基因上调了17.6倍,相应胞内NADPH水平提高了137%。因此,在对数生长初期36 h添加吐温-80具有双重功效,既提高了ODHC的表达又使NADPH积累,从而诱导L-赖氨酸的高产。

以L-苏氨酸为发酵底物的2,5-二甲基吡嗪高产菌株构建

构建一种以L-苏氨酸为发酵底物的高值化学品2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)生产菌株,为解决L-苏氨酸产能过剩,实现2,5-DMP生物法生产提供可靠思路。通过利用Bacillus subtilis 168(B.subtilis 168)外源表达不同微生物种属来源的L-苏氨酸脱氢酶(L-threonine dehydrogenase,TDH),并比较其利用L-苏氨酸为底物合成2,5-DMP的产量,挑选出2,5-DMP高产菌种,在此基础上进一步外源表达NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX),以促进辅因子再生。实验构建了1株高产2,5-DMP的基因工程菌株B.subtilis 168/pMA0911-tdh(E.c)-nox。该菌株以5.83 g/L的L-苏氨酸为底物,发酵24 h后2,5-DMP的产量高达616.04 mg/L,与对照菌株B.subtilis 168/pMA0911相比,产量提高了22.5倍。在TDH过表达的基础上,NOX的参与有利于2,5-DMP产量的提高。该研究首次实现了2,5-DMP高效的生物转化,一方面缓解了L-苏氨酸产能过剩的困境,另一方面有助于实现高值风味化合物2,5-DMP的生物法生产。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏时红细胞膜带3蛋白酪氨酸磷酸化的改变

目的 从红细胞膜蛋白磷酸化改变的角度探讨葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 (G6PD)缺乏症溶血的机制。方法 Westernblot法检测G6PD缺乏症的红细胞膜蛋白磷酸化的改变以及二硫苏糖醇 (DTT)对蛋白磷酸化的影响 ;以对硝基苯磷酸 (PNPP)为底物 ,测磷酸酪氨酸磷酸酶 (PTPs)活性以探讨磷酸化改变的可能成因。结果 G6PD缺乏的红细胞膜带 3(Band 3)蛋白酪氨酸的磷酸化水平较正常对照明显增多 ,而PTPs活性检测较正常对照明显减弱 ;DTT处理的G6PD缺乏红细胞 ,其膜Band 3蛋白酪氨酸的磷酸化与未处理者无明显差异 ,PTPs活性检测结果与未处理者亦无显著差异。结论 氧化致使G6PD缺乏红细胞的PTPs活性减弱 ,膜Band 3蛋白酪氨酸磷酸化增强 ,成为红细胞溶血的一个重要原因。但PTPs巯基的改变并不是影响PTPs活性的唯一因素。

同型半胱氨酸联合心肌酶测定在新生儿高胆红素血症诊断中的价值

目的探讨同型半胱氨酸(HCY)联合心肌酶谱检测在高胆红素血症新生儿中的临床价值。方法选择高胆红素血症新生儿455例,分别进行全血红细胞葡萄糖-6-磷酸酶脱氢酶(G-6-PD)活性、血清总胆红素、同型半胱氨酸(HCY)、心肌酶谱等测定,根据G-6-PD活性及血清总胆红素结果,将实验对象分为G-6-PD活性缺乏所致高胆红素血症组及普通高胆红素血症组,同时选择普通新生儿黄疸患者120例为对照组,将各组上述指标进行临床对比分析。结果 G-6-PD活性缺乏高胆红素血症组同型半胱氨酸较普通高胆红素血症组更高,心肌酶谱结果相比则差异无显著性,但高胆红素血症组患者上述指标与对照组比较则差异有显著性,结合临床资料及彩色多普勒超声检测结果,高胆红素血症患者中有2例诊断为心肌炎均为G-6-PD活性缺乏患者,39例诊断为亚临床心肌炎,55例疑诊心肌炎患者。结论高胆红素血症患者心肌细胞存在不同程度损伤,常规测定患者同型半胱氨酸联合心肌酶谱,对临床诊断新生儿心肌炎及亚临床心肌炎有积极意义,同型半胱氨酸是新生儿心肌细胞损伤独立危险因子。

超声心动图指标联合血清ARG1、G6PD在脓毒症患儿预后评估中的价值

目的探讨超声心动图指标联合血清重组人精氨酸酶1(ARG1)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)在脓毒症患儿预后评估中的价值。方法将2022年5月至2023年6月该院收治的116例脓毒症患儿纳入研究作为脓毒症组。根据脓毒症病情程度,将其进一步分为一般脓毒症组(52例)、严重脓毒症组(38例)和脓毒症休克组(26例),另根据患儿预后情况将脓毒症患儿分为预后良好组(84例)和预后不良组(32例)。选取同期于该院行体检的健康儿童116例纳入研究作为对照组。采用彩色多普勒超声仪对纳入研究者进行超声检查,检测受试者左心室射血分数(LVEF)、左室舒张末内径(LVEDD)、左室舒张末容积(LVEDV)及二尖瓣舒张早期血流峰值速度(E)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清ARG1、G6PD水平。比较脓毒症组与对照组、不同病情程度及不同预后脓毒症患儿超声心动图指标及血清ARG1、G6PD水平。采用受试者工作特征曲线(ROC)分析超声心动图指标联合血清ARG1、G6PD对脓毒症患儿预后不良的预测价值。结果与对照组比较,脓毒症组患儿LVEF、E及G6PD水平降低(P<0.05),而LVEDD、LVEDV及ARG1升高(P<0.05)。随着脓毒症病情程度的加重,脓毒症患儿LVEF、E、G6PD水平逐渐降低(P<0.05),而LVEDD、LVEDV及ARG1水平逐渐升高(P<0.05)。预后不良组脓毒症患儿LVEF、E、G6PD水平低于预后良好组(P<0.05),LVEDD、LVEDV、ARG1水平高于预后良好组(P<0.05)。ROC曲线分析显示,超声心动图指标联合血清ARG1、G6PD预测脓毒症患儿预后不良的AUC为0.971,灵敏度和特异度分别为84.4%、83.2%。结论脓毒症患儿LVEF、E、G6PD水平明显降低,LVEDD、LVEDV、ARG1水平明显升高。超声心动图指标联合血清ARG1、G6PD对脓毒症患儿预后不良具有较高的预测价值。

亮氨酸脱氢酶C端Loop区域的理性设计及多酶级联高效合成L-2-氨基丁酸

亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenase,LDH)是制备L-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成L-2-氨基丁酸。通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)值,对其波动非常明显的Loop区域合理设计以得到比酶活提高的截短突变体EsLDHD2,其比酶活为野生型的123.2%;此外,由于L-2-氨基丁酸制备过程中苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸制备2-酮丁酸的速率过快导致多酶催化不平衡,因此双拷贝亮氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶以平衡多酶催化速率,构建多酶级联催化的单细胞E.coliBL21/pACYCDuet-RM,其摩尔转化率相较于E.coliBL21/pACYCDuet-RO提高74.6%;对菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM的全细胞转化条件进行优化,其最适pH、温度、底物浓度分别为7.5、35℃和80 g/L,此时摩尔转化率大于99%;在1 L转化体系和最适转化条件下分批加入L-苏氨酸80 g和40 g,L-2-氨基丁酸的产量达97.2g。总之,该策略为L-2-氨基丁酸的制备提供了绿色、高效的合成方法,具有工业化制备药物前体的巨大潜力。

G6PD缺陷通过Caspase-3和PARP-1诱导人黑色素瘤细胞凋亡

葡糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)在许多肿瘤细胞中高表达,但其发生的作用机理目前仍然不明确.以正常人表皮黑色素细胞(HEM)、野生型人黑色素瘤A375细胞(A375-WT)和G6PD缺陷的A375细胞(A375-G6PDΔ)为对象,经real-time PCR、Western印迹和紫外分光光度法分析显示,A375-WT细胞的mRNA、G6PD蛋白和G6PD活性分别是HEM细胞的1.89倍(P<0.05)、6.86倍(P<0.01)和2.30倍(P<0.05).Annexin V/PI流式细胞仪和Western印迹测定表明,A375-G6PDΔ的凋亡率是A375-WT的5.10倍(P<0.01),活化半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)增高1.84倍(P<0.01)以及89 kD多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)生成增加2.87倍(P<0.01).分光光度法分析显示,A375-G6PDΔ的NADPH和GSH分别降低了72.30%(P<0.01)和27.39%(P<0.05),并伴有75.43%的H2O2增高(P<0.01).结果提示,G6PD在黑色素瘤细胞中高表达和高活性,而敲减G6PD表达通过caspase-3和PARP-1信号诱发人黑色素瘤细胞凋亡,这为深入揭示黑色素瘤的发生机理提供了新思路。

用于合成L-2-氨基丁酸基因工程菌的构建

构建了还原型辅酶Ⅰ(NADH)再生与亮氨酸脱氢酶(LDH)偶联的催化体系,合成甲酸脱氢酶(FDH)基因序列片段,连接入pET28a质粒,构建了pFDH-pET28a,转化入E.coli BL21(DE3)表达。经IPTG诱导后,FDH粗酶液的酶活力约10 u/ml。合成LDH基因序列,连接入pET21a质粒,构建了pLDH-p ET21a,将该质粒与pFDH-pET28a共转化入E.coli BL21(DE3),共表达FDH与LDH,与苏氨酸脱氨酶(TD)共同催化L-2-氨基丁酸的合成。投料量为7 g/100 ml时,该体系产率可达95%。

我国2015年新生儿遗传代谢病筛查指标切值的调查

目的调查我国新生儿遗传代谢病筛查检验指标的切值情况，为新生儿遗传代谢病筛查工作提供建议。方法调取国家卫生计生委临床检验中心2015年全国新生儿遗传代谢病筛查指标苯丙氨酸（Phe）、促甲状腺激素（TSH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）和17-羟孕酮（17-OHP）室间质量评价回报结果中切值相关信息，包括实验室编码、单位名称、所在地区、指标切值、切值来源、方法学原理、仪器、试剂和校准品。分析不同地区、方法学原理和切值来源对4个指标切值大小的影响。结果220家实验室中，切值来源中所占比例最高的3项依次为：试剂厂家说明书（48．2％-69．8％）、实验室自行确定（27．7％～35．2％）和新生儿疾病筛查技术规范（0．0％-20．0％）。参加研究的机构数量最多的3个省份分别为广东（25家）、山东（17家）和江苏（16家）。对切值情况调查显示：Phe切值分布在1．60～5．00mg／dL；TSH切值分布在4．82-18．00mlU／L；G6PD切值在2．00～10．00U／gHb；17-0HP切值在23．20～60．00nmol／L范围内。对于Phe指标，各来源组和方法组切值差异均有统计学意义（P均〈0．05）；对于TSH指标，各来源组间切值差异有统计学意义（P〈0．05），但方法组间差异无统计学意义（P〉0．05）；对于G6PD和17-OHP指标，不同来源和方法组的切值差异均无统计学意义（P均〉0．05）。结论各个检验指标切值较为一致，有个别实验室切值差异较大，建议各实验室对现有不同方法的切值进行评审。

全自动新生儿疾病筛查系统的性能评价

目的对全自动新生儿疾病筛查系统(GSP)进行性能评价。方法按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP15-A2文件的要求,对新生儿先天性甲状腺功能低下症(CH)、先天性肾上腺皮质增生症(CAH)、苯丙酮尿症(PKU)和葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症4种疾病筛查的对应检测指标——促甲状腺素(TSH)、17-羟基孕酮(17-OHP)、苯丙氨酸(Phe)和G6PD进行检测,评价GSP的精密度、正确度、线性范围等,并与目前临床常规使用的荧光酶免疫分析法(TSH、17-OHP)和荧光法(Phe、G6PD)进行比对。结果 GSP检测TSH、17-OHP、Phe、G6PD批内不精密度和总不精密度均在厂商要求的范围内;与美国疾病预防控制中心(CDC)新生儿筛查室间质评样本靶值的偏移为-8.37%~12.96%,均<1/2允许总误差(TEa)。线性回归方程的截距b为0.83~1.69,r^2>0.95,达到厂商声明的线性要求(r^2≥0.90)。GSP与荧光酶免疫分析法和荧光法的一致性非常好(Kappa值分别为0.83、0.73、0.93和0.97,P<0.001),检测结果高度相关(r值分别为0.97、0.94、0.99、0.91,P<0.001)。结论 GSP的精密度、正确度、线性范围均达到了厂家声明的检测性能,可用于临床检测。

红豆杉细胞中的酚类化合物含量与紫杉醇产量之间的关系

研究了在真菌诱导子诱导红豆杉细胞时酚类化合物与紫杉醇产量之间的关系。结果表明:真菌诱导子处理提高了细胞的G6PD、PAL的活性和酚类化合物含量;真菌诱导子和谷氨酸的联合处理也可提高细胞中G6PD、PAL的活性,且联合处理后的酶活性较真菌诱导子单独处理的要高。联合处理后紫杉醇产量与酚类化合物的变化相似,均是前期低于真菌诱导子处理,后期高于诱导子处理;PAL的抑制剂AOA显著降低真菌诱导子处理的酚类化合物和紫杉醇的产量,同时细胞死亡明显增加。因此认为,酚类化合物与细胞诱导时的紫杉醇产量有关,细胞诱导时保持一定浓度的酚类化合物有利于紫杉醇产量的提高。