重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的提取纯化工艺

采用渗透振扰破壁法、硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、DEAE-纤维素层析等步骤提取和纯化重组L-门冬酰胺酶,并优化了提纯过程的条件,提取总回收率高于50%,产品纯度经高效毛细管电泳检测为单一峰,具有工业生产前景。

重组L-门冬酰胺酶空前体脂质体的研制及其包封率的测定

采用乳化挤压冻干三步法完成空前体脂质体的制备.空前体脂质体以L门冬酰胺酶为实验对象,测定了包封率.制得的前体脂质体水合形成的L门冬酰胺酶脂质体形态圆整,粒径在(0.662±0.0792)μm范围内.3批前体脂质体对L门冬酰胺酶的包封率分别为(48.2±0.99)%、(51.0±1.21)%、(52.2±1.25)%.3个批号的包封率变异系数(RSD%)均小于3%.结果说明制备的空前体脂质体水合形成的L门冬酰胺酶脂质体粒度适宜,可用于L门冬酰胺酶的包封.

重组L-门冬酰胺酶前体脂质体对急性淋巴白血病小鼠的治疗作用和毒性考察

目的 :考察重组L 门冬酰胺酶前体脂质体 (L ASNasePL)与重组L 门冬酰胺酶 (L Asparaginase ,L ASNase)对移植性小鼠急性淋巴白血病的作用 ,及相关急性毒性。方法 :采用DBA/2小鼠L12 10 腹水瘤模型 ,L ASNasePL组和L ASNase组小鼠每天腹腔注射一次 ,连续 10d。另设L ASNasePL组小鼠静脉注射给药 ,给以最大药物浓度 (4 0 0 0kU·m1-1) ,最大静脉注射体积 [0 .5m1·(2 0g) -1];L ASNase组给药体积为 0 .4ml·(2 0g) -1,给药一次后每天记录小鼠情况 ,共 14d。用Bliss法计算LD50 。结果 :L ASNasePL及L ASNase皆能显著延长L12 10 的小鼠存活天数 (P <0 .0 1) ,L ASNasePL对L12 10 移植小鼠 ,生命延长率最高达 184.7%。L ASNase组生命延长率最高为 132 .9%。L ASNasePL的毒性与L ASNase相比明显降低 ,其小鼠静注的L ASNasePL的最大耐受量为 10 .0× 10 5kU·kg-1。L ASNasePL及L ASNase对小鼠体重无明显影响。结论 :高、中剂量L ASNasePL与同剂量的L ASNase相比 ,均显著延长L12 10 小鼠的存活天数 (P <0 .0 5 )。L ASNasePL急性毒性明显小于L AS Nase。

L-门冬酰胺酶前体脂质体对小鼠毒性及对实验性肿瘤作用

目的 :研究 L-门冬酰胺酶 ( L-Asparaginase,L-A)前体脂质体 ( Proliposome,PL) [L-APL]iv对小鼠的毒性及对荷瘤小鼠的抗肿瘤活性。方法 :以小鼠的急性毒性和外周血中白细胞数及血小板数为指标观察药物对小鼠的毒性及以荷瘤小鼠的瘤重和生命延长率观察药物的抗肿瘤活性。结果 :L-APL i V对小鼠的急性毒性与 L -A相比明显降低 ,L-APL对正常小鼠外周血中白细胞数、血小板数无明显影响 ,而相同剂量 L-A对小鼠外周血中白细胞数、血小板数明显降低。与对照组相比 ,L-APL及 L-A ip可明显延长腹水型小鼠移瘤 L1 2 1 0 、P388的存活天数 ,与同剂量 L-A相比 ,L-APL高剂量有明显延长腹水型小鼠移植瘤的存活天数作用。L-APL及 L-A ip对小鼠移植瘤 Heps、EC实体型的肿瘤生长具有明显的抑制作用 ,两者抑瘤作用相近。结论 :L-APL对小鼠的毒性明显小于相同剂量的 L-A,L-APL不仅保持了 L-A的抗肿瘤活性 ,而且有明显的增效作用。

重组L-门冬酰胺酶前体脂质体与重组L-门冬酰胺酶对小鼠毒性作用比较

为了考查L 门冬酰胺酶 (L Asparaginase ,L ASNase)前体脂质体 (Proliposomes) (L ASNasePL)与L ASNase的急性毒性及对外周血中白细胞总数及血小板数的作用。脂质体组小鼠静脉注射给药 (L ASNasePL) ,给药剂量为给以最大药物浓度 (4 0 0 0KU/m1) ,最大静脉注射体积 (0 5m1/ 2 0 g) ;L ASNase组给药体积为 0 4ml/ 2 0 g ,给药一次 ,给药后每天观察记录小鼠活动、死亡情况 ,共观察 14d。结果L ASNasePL的毒性与L AS Nase相比明显降低 ,其小鼠iv的L ASNasePL的最大耐受量为 10 0× 10 5KU/kg ,相当于每日人临床拟用剂量的5 0 0 0倍。对正常小鼠体重、外周血中白细胞总数及血小板数的影响 :L ASNase高剂量组 (10 0 0KU/kg)有显著降低小鼠外周血中白细胞总数及血小板数的作用 (P <0 0 5 ) ,而L ASNasePL对小鼠外周血中白细胞总数及血小板数无明显影响。L ASNasePL组及L ASNase组对小鼠体重增长均无明显影响。说明L 门冬酰胺酶前体脂质体急性毒性明显小于L 门冬酰胺酶 ,L

重组L-门冬酰胺酶工程菌的表达和PEG的化学修饰

目的提高重组L-门冬酰胺酶(rL-ASP)工程菌的表达量,分离纯化rL-ASP并对之进行PEG化学修饰。方法将带有编码rL-ASP的基因的质粒(pKA)导入不同的宿主菌中,挑出高表达菌株,同时优化发酵培养基,分离纯化获得的高纯度rL-ASP再用PEG进行化学修饰,SDS-PAGE检测修饰效果。结果在pH7.0的条件下,宿主菌为JMl09的工程菌pKA/JMl09酶活力最高,三角瓶振摇培养的酶活力可达216×103IU/L;发酵罐发酵培养,酶活力达312×103IU/L。纯化后的rL-ASP比活力为220IU/mg,rL-ASP经过PEG化学修饰生成rL-ASP-PEG,分子量发生改变。结论改变目标蛋白表达的宿主菌和优化发酵工艺,提高了rL-ASP的表达量,纯化的rL-ASP经过PEG化学修饰后分子量增大。

C端融合RGD三肽的重组L-门冬酰胺酶基因克隆、表达和对血液系统的影响

利用加端PCR技术构建asnB-RGD工程菌,获得C末端带有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸,Arg-Gly-Asp)三肽的门冬酰胺酶(AnsB-RGD),以改进L-门冬酰胺酶的作用。以pUA18为模板,利用pUC18上游普适引物和根据L-门冬酰胺酶Ⅱ基因(ansB)C末端下游序列设计的引物来扩增目标基因。将目标基因连于pMD18-T载体,转化宿主菌JM109,筛选出的阳性克隆通过HindⅢ、Nco I双酶切下目标基因连到含T7启动子的高效表达载体pET28a上,再转化BL21宿主菌。高效表达的工程菌摇瓶发酵,渗透休克法提取AnsB-RGD融合蛋白,12％的SDS-PAGE检测酶蛋白并考察酶的活力、特异性及其对血液系统的影响。2％琼脂糖凝胶电泳、DNA测序鉴定构建的pET28a-ansB-RGD工程菌,奈氏法、SDS-PAGE及免疫学方法检测AnsB-RGD融合蛋白。DNA序列分析证明RGD三肽已经连接在L-门冬酰胺酶的C末端,带有RGD三肽的融合蛋白仍然能与抗L-门冬酰胺酶的抗体结合,初步发现AnsB-RGD融合蛋白有促进血液凝固作用,但酶活力下降。

重组L-门冬酰胺酶的聚乙二醇化学修饰及修饰后酶的稳定性研究

目的单甲氧基聚乙二醇 (mPEG)化学修饰大肠杆菌重组L 门冬酰胺酶 (L ASP) ,考察经过修饰的酶的稳定性。方法N 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)活化酯法活化mPEG ,生成的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰琥珀酸亚胺酯 (SS mPEG)按不同摩尔比例与L ASP偶联 ,确定适合的反应时间和反应pH值。通过聚乙二醇化学修饰后的酶 (L ASP PEG) ,酶活力和纯度通过奈氏法和丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)检测 ,高效液相色谱检测L ASP PEG相对分子质量并考察了L ASP PEG体外稳定性等。结果SDS PAGE显示mPEG已经偶联到L ASP分子上 ,以两者摩尔比 1 0∶1为最佳 ,反应pH条件为 8.5 ,获得的L ASP PEG平均比活单位为 6 4 .8IU/mg ,相对分子质量为 30 1 80 0 ,体外稳定性高于L ASP。结论此实验确定了mPEG化学修饰L ASP最佳反应条件为 2 5℃反应 30min ,两者投料摩尔比为 1 0∶1 ,获得的L ASP PEG比L

几种修饰剂共价修饰L-门冬酰胺酶降低其抗原性的对比研究

选用单甲氧基聚乙二醇、右旋糖苷、磺化右旋糖苷,肝素及小分子醋酸酐对酶分子进行了共价修饰,研究了不同修饰剂对酶分子的酶活力及其抗原性的影响。结果表明,大分子,特别是单甲氧基聚乙二醇的降低抗原性效果很好,但活力损失较大;修饰剂分子量越大,酶表面氨基修饰程度越高,解除抗原性效果越好。

L-门冬酰胺酶的稳定性研究

目的探讨临床配制L-门冬酰胺酶(L-ASP)注射液时出现浑浊的原因及解决办法。方法用5%NaHCO3注射液调整L-ASP注射液pH值,观察不同PH下输液的外观及不溶性微粒数的变化。结果L-ASP注射液出现浑浊的原因在于溶媒pH值的不合理,用5%NaHCO3调整溶媒pH值为7.5时L-ASP静脉注射最稳定。结论此方法简便,价格低廉,有推广价值。

聚乙二醇化学修饰的重组L-门冬酰胺酶对小鼠白血病细胞P_(388)的抑制作用

目的 :考察聚乙二醇 (polyethyleneglycol,PEG)化学修饰的重组L 门冬酰胺酶 (recombinantL asparaginase ,rL ASP)的抗肿瘤活性。方法 :PEG化学修饰rL ASP ,获得的化学修饰酶 (polyethylenegly colmodifiedrecombinantL asparaginase ,rL ASP PEG)利用十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (sodi umdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis ,SDS PAGE)观察其分子大小变化 ,四甲基偶氮唑盐(3 (4 ,4 dimcthylthioazol 2 yl) 2 ,5 diphenyl tetrazoliumbromide ,MTT)法和流式细胞仪 (flowcytometer,FCM )检测rL ASP PEG对体外培养的小鼠白血病细胞P3 3 8增殖作用的抑制作用 ,腹腔给药考察rL ASP PEG对小鼠移植性实体瘤P3 3 8抑瘤效果 ,透射电镜(transmissionelectronmicroscopy ,TEM )观察rL ASP PEG引起的肿瘤组织超微病理变化。结果 :SDS PAGE显示 ,rL ASP PEG的分子量大于rL ASP ;MTT实验表明 ,rL ASP PEG能抑制体外培养的小鼠P3 88白血病细胞的增殖 ,半数有效浓度 (inhibitoryconcen tration 5 0 % ,IC50 )为 2 .0 5 6IU·ml-1。FCM结果表明 ,rL ASP PEG主要将肿瘤细胞P3 88抑制在G0 +G1期 ,S期细胞减少。DBA 2荷瘤小鼠的抑瘤实验表明rL ASP PEG对移植性实体瘤P3 3 8有显著抑制作用 。

重组L-门冬酰胺酶前体脂质体对HL-60细胞的生长影响

目的:研究L-门冬酰胺酶脂质体对体外培养的人早幼粒细胞白血病(HL-60)细胞活性的影响.方法:MTT测定L-门冬酰胺酶脂质体的抗肿瘤活性,电镜观察药物对肿瘤细胞形态学的影响,流式细胞仪检测药物对肿瘤细胞周期的影响.结果:L-门冬酰胺酶脂质体(经前体脂质体水合而得)组与肿瘤细胞作用后,HL-60细胞的G0/G1期细胞量明显增加,而进入S期的细胞明显减少.增殖指数L-门冬酰胺酶脂质体组的PI值显著下降.HL-60细胞凋亡比例显著增多.结论:L-门冬酰胺酶脂质体抑制HL-60细胞的繁殖,可能与抑制细胞的S期有关.

重组L-门冬酰胺酶前体脂质体对HL-60细胞生长的影响

目的:研究L-门冬酰胺酶(L-ASNase)脂质体对体外培养的人早幼粒细胞白血病(HL-60)细胞活性的影响。方法:实验分3组:对照1组加入新鲜RPMI1640培养液倍比稀释的空白脂质体;对照2组加入L-ASNase(终浓度分别为2.5,5,10,20和40μg·mL-1);实验组加入L-ASNase脂质体(前体脂质体水合而得,终浓度分别为2.5,5,10,20和40μg·mL-1)。MTT法测定细胞存活率,电镜观察细胞形态学,流式细胞仪检测肿瘤细胞周期的改变。结果:L-门冬酰胺酶脂质体(经前体脂质体水合而得)组HL-60细胞的G0/G1期细胞量明显增加,S期的细胞明显减少;增殖指数(PI)显著下降;HL-60细胞凋亡比例显著增多。结论:L-门冬酰胺酶脂质体抑制HL-60细胞的繁殖,可能与抑制细胞的S期有关。

单甲氧基聚乙二醇修饰L-门冬酰胺酶的研究

用一种单甲氧基聚乙二醇修饰剂修饰L-门冬酰胺酶,初步确定了最佳修饰条件,应用阴离子交换色谱和分子筛色谱分离纯化得到单修饰产物,酶活性回收率在40%以上,修饰产物的稳定性提高,免疫原性显著下降。

L-门冬酰胺酶突变体的构建及其活性测定(英文)

目的:将L-门冬酰胺酶抗原表位区域的两个肽段作为突变对象,构建9个突变体,并对其酶活力和蛋白表达量与原酶进行比较研究。方法:根据丙氨酸扫描原理,应用重叠延伸PCR技术构建突变体,并对突变菌株进行基因测序和酶活力测定。结果:构建成功的突变菌株均具有酶活力,且蛋白表达水平不受影响。结论:首次采用基因修饰,改变L-门冬酰胺酶抗原表位区域的肽段,而不影响其酶活力,为后续研究和探讨L-门冬酰胺酶抗原表位结构与功能的关系提供了基础。

工业化生产L-门冬酰胺酶发酵条件的研究

目的探讨不同发酵条件对L 门冬酰胺酶生产发酵的影响。方法对发酵罐的高径比、搅拌器转速、通气量及初始 pH值等控制因素进行研究。结果及结论增加罐体高径比值 ,提高搅拌速度 ,提高发酵通气量及适当的初始 pH值是提高L

大肠杆菌L-门冬酰胺酶Ⅱ作为多肽呈现载体的可行性研究

为了研究大肠杆菌L-门冬酰胺酶Ⅱ(L-asparaginaseⅡ,AnsB)能否作为多肽呈现载体。选取乙肝病毒表面抗原(HBSAg)preS2结构域的核心抗原表位区作为模型多肽,构建了两种表达载体pET28a-AnsB-preS2L和pET28a-AnsB-preS2C,分别转化至表达宿主菌E.coliBL-21,LB培养基(Kanr)培养,乳糖诱导高效表达,通过渗透休克,DEAE 52-cellulose柱层析纯化获得了在AnsB C端融合有线状和环状模型多肽的嵌合酶AnsB-preS2L和AnsB-preS2C,两种嵌合酶分别保留了AnsB 81%、25%的催化活力,两者的pH稳定性均与AnsB相符。ELISA检测结果显示AnsB-preS2L与抗preS2抗体的结合能力较AnsB-preS2C强。证明AnsB确实能够作为一种表面呈现载体将线性外源多肽以融合表达的方式呈现在酶分子的表面,最终形成一种在每个亚基表面呈现有多肽的嵌合酶。最后,用富含带电序列的8肽(KRKRKKSR)替换核心抗原表位区作为模型多肽,进一步验证了AnsB作为多肽呈现载体的可行性和通用性。

L-天冬门酰胺微生物电极的研制

以谷氨酸棒状杆菌（ATCC13032）作为生物催化剂，与基础氨气敏电极结合制成对L-天冬门酰胺响应的微生物电极。在30℃时选择pH＝8．5的硼酸缓冲体系，测得电极的线性范围为7．1×10－5～1．1×10－2mol／L，斜率为51．4mV／dec，检测下限为2．0×10－5mol／L，响应时间为4～7min，寿命达30d以上。

L-门冬酰胺酶治疗急性淋巴细胞性白血病的不良反应及护理

Ｌ门冬酰胺酶治疗急性淋巴细胞性白血病的不良反应及护理庄文萍许秀萍（山东省临沂市人民医院临沂市２７６０００）关键词Ｌ门冬酰胺酶；急性淋巴细胞性白血病；护理Ｌ门冬酰胺酶（ＬＡＳＰ）是一种对肿瘤细胞具有选择性抑制作用的药物。笔者１９９２～１９９６年...

反相高效液相色谱结合柱前衍生化法测定人血清中L-门冬酰胺

目的:建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC)快速准确测定人血清中L-门冬酰胺(L-ASN)。方法:用已耗竭L-ASN的人血清为空白生物基质建立标准曲线,邻苯二甲醛在线柱前衍生样品,ZORBAX Eclipse AAA柱(4.6 mm×150 mm,5μm)分离衍生化产物。采用内标法根据荧光响应值定量分析。结果:L-ASN与内标高丝氨酸的衍生物均在16 min内出峰,在2～100μmol.L-1的范围内方法线性关系良好(r>0.999),最低定量限为2μmol.L-1,日内与日间精密度(RSD)均小于12.9%,回收率在96.9%～108.3%之间,平均提取回收率为58.2%,血清中L-ASN-80℃冻存四周保持稳定。结论:建立了RP-HPLC结合柱前衍生化测定人血清中L-ASN的方法,并应用于临床血清样品中L-ASN的定量测定。