基因工程法生产L-5-甲基四氢叶酸的研究

目的在E.coli BL21(DE3)中表达5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR),并检测MTHFR的表达情况及L-5-甲基四氢叶酸的增加量。方法采用PCR法获得MTHFR基因(metF)全长DNA,分别在其5'端和3'端加上BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。经BamHⅠ和SacⅠ双酶切后,连接到经同样双酶切的表达载体pET-28a(+)中,经限制性酶切、菌落PCR和测序验证正确后,转化至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测MTHFR表达量,HPLC检测L-5-甲基四氢叶酸量。结果经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pET28a-MTHFR构建成功,表达产物相对分子质量约为33 000,与MTHFR大小相符,工程菌的L-5-甲基四氢叶酸的产量显著增加。结论通过将MTHFR的基因导入L-5-甲基四氢叶酸产生菌能够提高L-5-甲基四氢叶酸产量。

手性色谱法测定L-5-甲基四氢叶酸钙含量

建立手性色谱法测定L-5-甲基四氢叶酸钙(L-5-MTHF-Ca)的分析方法,通过方法学验证评价方法的可行性。使用高效液相色谱系统,色谱柱为CHIRALPAK HSA手性色谱柱(4 mm×150 mm,5μm),以磷酸盐缓冲溶液∶乙腈(体积比90∶10)为流动相,流速0.6 mL/min,进样量5μL,柱温30℃,检测波长280 nm。方法学验证结果表明,此方法可很好地分离L-5-MTHF-Ca,分离度达到3.24,并且在0.016~0.100 mg/mL质量浓度范围线性关系良好,相关系数为0.9997,检出限为3.11μg/mL,定量限为4.98μg/mL,精密度0.38%,加标平均回收率103.71%,系统适用性良好,然而,L-5-MTHF-Ca会随时间缓慢降解,需尽快进样分析。方法操作简便,结果准确,可用于各种食品、保健品中L-5-MTHF-Ca含量的测定。

高效液相色谱法测定L-5-甲基四氢叶酸钙

目的建立高效液相色谱法测定L-5-甲基四氢叶酸钙的分析方法。方法用C_(18)(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以磷酸盐缓冲液、甲醇:磷酸盐缓冲液(35:65, V:V)为流动相,流速为1.1 mL/min,用高效液相色谱法进行测定;检测波长为280 nm。结果该方法检出限为0.015μg/mL,定量限为0.05μg/mL,相对标准偏差为0.31%。对供试品中L-5-甲基四氢叶酸钙的回收率达到114%。对5%目标物本底浓度加标回收率达到97.3%。对10%目标物本底浓度加标回收率达到98.5%。结论该方法检测准确、可靠,回收率均较高,说明该方法适用于检测L-5-甲基四氢叶酸钙。

菌体中L-5-甲基四氢叶酸的HPLC法检测

目的:建立高效液相色谱法测定菌体中L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)的方法。方法:加热法破碎细胞,强碱性阴离子交换树脂纯化,高效液相色谱柱为C18反向柱,流动相为K2HPO4(0.02 mol.L-1,pH7.2)-甲醇(84∶16)溶液,流速为1.0 mL.min-1,柱温为40℃,检测波长为290 nm。结果:L-5-MTHF在0.5～50μg.mL-1范围内线性良好,r=0.999 5,RSD为1.11%。结论:色谱法灵敏、准确、重现性好,可用于菌体中L-5-甲基四氢叶酸的定性与定量。

产L-5-甲基四氢叶酸工程菌自动诱导培养基的优化

考察了自动诱导培养基代替异丙基-β-D-巯基半乳糖苷(IPTG)培养基诱导四氢叶酸还原酶在重组大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性,对自动诱导培养基自诱导时的乳糖浓度和葡萄糖添加量进行优化,并与IPTG诱导培养基进行比较,确定了自动诱导培养基配方:葡萄糖1.8 mmol/L、乳糖3 mmol/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10 g/L。HPLC结果显示,自诱导与IPTG诱导条件下的L-5-甲基四氢叶酸产量接近。

重组甘氨酸脱羧酶基因工程菌生产L-5-甲基四氢叶酸

目的:针对叶酸代谢通路中的甘氨酸脱氢酶(GDC)构建高效表达GDC的重组菌E.coli BL21(pET22b-gcvP)并检测L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)的增加量。方法:采用PCR法获得GDC基因gcvP,分别在其两端加上HindⅢ和XhoⅠ酶切位点,经HindⅢ和XhoⅠ双酶切后,连接到经同样双酶切的表达载体pET22b中,经限制性内切酶酶切和测序验证正确后,转化至E.coli BL21中。乳糖诱导重组蛋白表达,进行SDS-PAGE电泳,HPLC检测L-5-MTHF产量。结果:经双酶切与测序鉴定证实原核重组载体pET22b-gcvP构建成功,表达产物相对分子质量约为104×103,与GDC大小相符。与原始菌相比,重组菌的L-5-MTHF的产量增加了23.1%。结论:重组甘氨酸脱羧酶基因工程菌能够提高L-5-MTHF产量。

高产L-5-甲基四氢叶酸基因工程菌的构建与表达

L-5-甲基四氢叶酸是叶酸最具生物活性的形式,也是唯一可以穿透血脑屏障的叶酸类药物,有极大的应用价值。为提高菌体内L-5-甲基四氢叶酸的含量,将5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF插入载体质粒,并将重组质粒pET-22b-metF转化至E.coliBL21(DE3),乳糖诱导蛋白表达。成功构建的重组菌经诱导后,L-5-甲基四氢叶酸量比原始菌株中提高28%,达到66μg/g菌体。本研究成功的为生物合成L-5-甲基四氢叶酸寻找到一种新的途径。

贵阳地区孕产妇5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性研究

目的研究贵阳地区孕产妇5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因多态性,为叶酸个性化增补方案提供参考依据。方法选取2018年11月至2019年10月于贵州中医药大学附属第一医院建档的3600名健康孕产妇作为研究对象,均进行MTHFR C677T、A1298C位点及MTRR A66G位点突变检测。分析贵阳孕产妇MTHFR和MTRR基因位点多态性分布及贵阳孕产妇叶酸代谢利用能力风险,比较不同地区叶酸代谢基因位点多态性分布。结果贵阳孕产妇MTHFR C677T位点频率分别为CC(37.78%)、CT(47.58%)及TT(14.64%),等位基因频率分别为C(61.57%)和T(38.43%);MTHFR A1298C位点频率分别为AA(62.39%)、AC(33.31%)及CC(4.31%),等位基因频率分别为A(79.04%)和C(20.96%);MTRR A66G位点频率分别为AA(57.67%)、AG(36.39%)及GG(5.94%),等位基因频率分别为A(75.86%)和G(24.14%)。贵阳地区孕产妇MTHFR C677T位点TT纯合突变型频率低于郑州及胶东地区孕产妇,整体叶酸代谢利用水平高于郑州与胶东地区孕产妇,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,贵阳地区孕产妇MTHFR C677T位点TT纯合突变型频率低于绍兴地区高同型半胱氨酸(Hcy)水平孕产妇,而MTHFR A1298C位点AC杂合突变型、CC纯合突变型频率高于绍兴地区高Hcy水平孕产妇,差异有统计学意义(P<0.05)。贵阳地区孕产妇与其他地区MTHFR A1298C及MTRR A66G位点突变频率比较差异无统计学意义。结论因不同地区人口遗传结构特征,叶酸代谢相关的MTHFR C667T、MTHFR A1298C、MTRR A66G 3个基因位点频率分布具有明显地域差异,特别是MTHFR C677T位点的地区差异显著,需根据地区基因突变情况实施个性化的叶酸增补方案。

反相高效液相色谱法测定乳粉中6S-5-甲基四氢叶酸钙含量

建立乳粉中6S-5-甲基四氢叶酸钙的反相高效液相色谱分析方法。使用三氯乙酸溶液沉淀蛋白,抗坏血酸溶液加热提取后,以C_(18)反相色谱柱分离,三氟乙酸溶液(0.1%)-甲醇为流动相,采用梯度方式洗脱,检测波长280 nm,单标法定量。结果表明:乳粉样品中6S-5-甲基四氢叶酸钙的定量限为150μg/100 g,检出限为50μg/100 g;乳粉中6S-5-甲基四氢叶酸钙的添加量为150~600?μg/100 g时,加标回收率为95.0%~109.1%,相对标准偏差为1.26%~4.04%。本方法操作简便、准确、回收率高、重复性好,适用于乳粉中6S-5-甲基四氢叶酸钙的含量测定。

L-5-甲基四氢叶酸钙在SD大鼠体内的药代动力学研究

目的建立测定SD大鼠血浆中L-5-甲基四氢叶酸钙(5-MTHF)浓度的高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS法),初步考察5-MTHF在SD大鼠体内的药代动力学(PK)参数。方法给予6只雄性SD大鼠口服1.5×10^(-2)mmol·L^(-1)·kg^(-1)5-MTHF,采集血样用于HPLC-MS/MS分析。用蛋白沉淀法处理血浆样本,色谱柱:Grace Altima HP C_(18),流动相A:甲醇-乙腈-异丙醇-乙醇-水-甲酸-二甲基亚砜(25∶25∶25∶25∶0.1∶1);流动相B:甲醇-水-甲酸(10∶90∶0.1);梯度洗脱:0.40 mL·min^(-1)。考察该方法的线性范围、准确度和精密度、回收率、基质效应及稳定性。用WinNonlin软件计算5-MTHF在SD大鼠体内的PK参数。结果 5-MTHF在10.00~1.00×10~4ng·mL^(-1)内线性关系良好,回归方程为y=1.01×10^(-3)x+1.82×10^(-3)(r=0.998 3),日内和日间的准确性和精密度、回收率、基质效应及稳定性符合要求。5-MTHF在SD大鼠体内的PK参数:不扣除本底5-MTHF浓度值的t_(1/2)为(15.23±5.76)h,AUC_(0~t)为(2788.52±348.86)ng·mL^(-1)·h,扣除本底5-MTHF浓度值的t_(1/2)为(1.57±0.34)h,AUC_(0~t)平均值为(971.80±237.58)ng·mL^(-1)·h。结论本研究建立了一种灵敏的、准确的用于SD大鼠血浆中5-MTHF浓度测定的HPLC-MS/MS法。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与胃癌患者对5-FU化疗敏感性的关系

背景和目的亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)基因变异影响MTHFR的活性,以致影响体内5,10-MTHF的浓度,从而影响5-FU的抗瘤活性。本研究旨在观察MTHFR基因C677T多态性对预测胃癌患者对5-FU的敏感性和化疗毒性的影响。方法收集经病理学确诊的晚期胃癌75例。所有病例化疗前抽外周静脉血2ml,用PCR-RFLP技术检测研究对象的MTHFR基因型。基因型分为野生型纯合子(C/C)、杂合子(C/T)、变异型纯合子(T/T)3种类型。所有患者经含5-FU为基础的联合化疗方案化疗。结果75例晚期胃癌患者中,MTHFRC/C基因型24例(32.0%),MTHFRC/T基因型33例(44.0%),MTHFRT/T基因型18例(24.0%)。其中22例PR,29例NC,24例PD,化疗总有效率29.3%。MTHFRT/T基因型患者的化疗有效率(20/24,83.3%)明显高于MTHFRC/C基因型患者(2/24,8.3%)(χ2=24.01,P<0.001),同样高于MTHFRC/T基因型患者(5/33,15.2%)(χ2=22.7,P<0.001)。MTHFRC/C基因型患者的化疗有效率与MTHFRC/T基因型患者之间无显著性差异(χ2=0.6,P=0.439)。非条件多元Logistic回归分析(调整性别、年龄、化疗方案、辅助化疗因素的影响)结果显示C/C+C/T基因型患者对化疗有效的可能性为T/T基因型患者的0.017倍(95%CI0.003～0.102,P<0.001)。

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性与原因不明复发性流产关联的Meta分析

目的探讨5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T基因多态性与原因不明复发性流产(URSA)之间的关联性。方法通过对万方、中国知网(CNKI)和Pubmed数据库进行相关已发表文献的检索,共查找出94篇文献,进一步按照既定的筛选标准进行筛选,最终将其中22篇文献纳入本次研究,进而针对MTHFR C677T基因多态性与URSA之间关联的病例对照研究进行Meta分析。结果对所有22篇文献中共包括URSA患者2 198人,正常对照2 612人进行统计合并后结果显示,基因型为TT和CT的女性其发生URSA的风险较基因型为CC者分别高93%和22%,即OR值分别为1.93〔95%CI(1.39,2.68)〕、1.22〔95%CI(0.99,1.50)〕;基因型为TT或CT的女性其发生URSA的风险较基因型为CC者高36%,即OR值为1.36〔95%CI(1.10,1.67)〕;T等位基因携带者发生URSA的风险较C等位基因携带者高34%,即OR值为1.34〔95%CI(1.14,1.58)〕。对所有9篇有关中国人群的文献进行统计合并后结果显示,基因型为TT和CT的女性其发生URSA的风险较基因型为CC者分别高267%和62%,即OR值分别为3.67〔95%CI(2.68,5.03)〕、1.62〔95%CI(1.29,2.05)〕;基因型为TT或CT的女性其发生URSA的风险较基因型为CC者高105%,即OR值为2.05〔95%CI(1.65,2.55)〕;T等位基因携带者发生URSA的风险较C等位基因携带者高89%,即OR值为1.89〔95%CI(1.64,2.18)〕。对13篇来自除中国以外的其他国家的文献进行统计合并后结果显示,各基因型的分布在URSA组和正常对照组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论在中国女性人群中,MTHFR C677T基因多态性与URSA的发生之间存在关联。而在除中国以外的其他国家中并未发现二者间存在关联。

不同5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因型人群叶酸补服效果评价

目的对不同5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因型人群叶酸补服的效果进行评价。方法根据MTHFRC677T基因型将113名健康女性分为CC、CT、TT3组,每组内再随机分为干预组和对照组,干预组给予口服叶酸片400μg/d,服药2个月,对照组不补服叶酸。分别于基线和干预2个月后检测血浆叶酸、红细胞叶酸、血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平。结果基线时,TT基因型血浆叶酸低于CC基因型和CT基因型,而TT基因型血浆Hcy高于CC基因型和CT基因型(P<0.05或P<0.01)。补服叶酸2个月后,干预组血浆叶酸水平和红细胞叶酸水平均不同程度的升高,血浆Hcy水平下降。其中,TT基因型的血浆叶酸上升最明显(相较于CC和CT,均P<0.05);其血浆Hcy下降也最显著(相较于CT,P<0.05)。Logistic回归分析显示,MTHFR基因型为TT是血浆Hcy偏高的危险因素,其风险是CC型的8.078倍。结论对于3种MTHFR基因型叶酸干预均可升高血浆叶酸和红细胞叶酸,降低血浆Hcy水平。TT基因型发生叶酸代谢障碍、血浆Hcy偏高的风险最高。尚不能证实小剂量补服叶酸可以降低血浆Hcy偏高的风险。

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与不育不孕症相关性研究进展

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶是叶酸代谢通路中的关键酶,在编码该酶的MTHFR基因中已发现多种单核苷酸多态性位点可能导致该酶活性的降低。该酶维持体内同型半胱氨酸正常水平及参与DNA的合成。MTHFR基因多态性被发现可能与男性不育及育龄女性复发性流产有关,将可能导致体内高同型半胱氨酸水平和DNA合成障碍及低甲基化反应,使人体叶酸代谢发生障碍。本文就5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性对男性不育、育龄女性复发性流产的影响进行综述。

N^5,N^(10)-亚甲基四氢叶酸还原酶基因与缺血性脑卒中发病的关系

目的探讨N5,N10亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因与缺血性脑卒中发病的关系。方法454例缺血性脑卒中患者按照TOAST(Trail of ORG10172in Acute Stroke Treatment)分型分为大动脉粥样硬化型(LAA)、心源性脑梗死型(CE)、小动脉阻塞型(SAA)、其他明确病因的中风型(SOE)和不明原因的中风型(SUE);根据神经功能缺损评分分为轻、中、重型。应用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱(DHPLC)技术筛查脑卒中组和334例无高血压病、冠心病、脑血管疾病、糖尿病、癌症、肾功能衰竭等疾病的患者或健康人(对照组)的MTHFR基因C677T的多态分布,详细记录卒中危险因素。结果脑卒中组CC、CT、TT基因型频率分别为51.8%、40.5%和7.7%,对照组分别为56.9%、38.3%和4.8%,TT基因型和T等位基因与中、重型缺血性脑卒中、LAA和CE型缺血性脑卒中相关。吸烟、酗酒、伴糖尿病群体TT基因型和T等位基因频率显著高于对照组(P均<0.10),CC基因型和C等位基因频率显著低于对照组(P均<0.05),而非吸烟、非酗酒、不伴糖尿病群体的各基因型和等位基因频率与对照组比较差异无显著性。结论TT基因型、T等位基因是缺血性脑卒中的易患因子;MTHFR基因与吸烟、酗酒、糖尿病在缺血性脑卒中的发病过程中存在协同作用。

积累5-甲基四氢叶酸双抗突变株的选育及条件优化

目的选育积累5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)的双重药物抗性高产突变株,探讨发酵时间和温度对叶酸积累形式的影响。方法紫外线和EMS联合诱变;磺胺、甲氨蝶呤药物培养基筛选菌株;单因素实验检测发酵条件对叶酸积累形式的影响;HPLC检测叶酸含量和存在形式。结果获得稳定性良好的抗性突变株,其叶酸产量是原始菌株的2.2倍。适合5-MTHF积累的发酵时间为16 h,积累量为68.94μg/g干菌。结论抗性突变株能提高菌株产叶酸能力,5-MTHF含量受发酵时间影响大,而发酵温度对产物形式和产量影响不显著。

脑梗死患者同型半胱氨酸、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与颈动脉粥样硬化的相关性

目的探讨脑梗死患者急性期血清同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate,MTHFR）基因多态性与颈动脉粥样硬化之间的相关性。方法研究共纳入90例急性脑梗死患者和40例正常人,用循环酶法测定血清Hcy水平;用彩色多普勒超声检查颈动脉颅外段;采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性方法检测MTHFR基因型多态性。结果病例组颈总动脉（CCA）及颈内动脉（ICA）内中膜厚度（IMT）较对照组显著增厚（1.07±0.30）mm vs（0.87±0.33）mm,（1.00±0.31）mm vs（0.65±0.16）mm（均P〈0.01）。病例组较对照组颈动脉斑块发生率显著增高（74.4%vs 45.0%,P〈0.01）。病例组中不稳定斑块占所有斑块的比例较对照组中有增高的趋势,但差异无统计学意义（P〉0.05）。C/C、C/T、及T/T基因型人群血清Hcy水平分别为12.95（9.50~16.58）μoml/L,19.08（12.05~25.63）μoml/L,28.32（18.00~36.80）μoml/L,呈递增趋势,各组间差异有统计学意义（均P〈0.05）。Logistic回归分析显示在校正了传统的危险因素后,Hcy仍然是颈动脉粥样硬化的独立危险因素（P〈0.01）;MTHFRC677T基因多态性未进入回归方程。结论血清Hcy升高是脑梗死独立危险因素;MTHFRC677T基因多态性与颈动脉粥样硬化无相关性。

中国人群5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与非综合征性唇腭裂关系的Meta分析

目的评价5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性与中国人群非综合征性唇腭裂(NSCL/P)的关系。方法计算机检索中国生物医学文献数据库、中国学术期刊全文数据库、万方中文科技期刊全文数据库、重庆维普中文科技期刊全文数据库等,检索时间范围2000年1月—2012年12月。选择MTHFR基因C677T多态性与NSCL/P的病例对照研究,评价纳入研究质量,并采用RevMan 5.0统计学软件进行定量分析。结果共纳入7个病例对照研究。Meta分析结果表明,携带T等位基因人群患有NSCL/P的危险性高于携带C等位基因人群〔OR=1.48,95%CI(1.06,2.07)〕。携带TT基因型人群NSCL/P发病危险性高于非携带TT基因型人群〔OR=1.35,95%CI(1.01,1.80)〕。携带CT和TT基因型人群NSCL/P发病危险性高于携带CC基因型人群〔OR=2.40,95%CI(1.20,4.77)〕。结论 MTHFR基因C677T多态性与我国人群NSCL/P的易患性密切相关。

样品前处理对检测柑橘中5-甲基四氢叶酸的影响

5-甲基四氢叶酸是叶酸的1种衍生物,是叶酸在柑橘中存在的最主要形式。由于其不稳定及柑橘果实成分复杂,导致叶酸的检测较为困难。要准确测定柑橘中5-甲基四氢叶酸的含量,柑橘样品的前处理非常重要。采用高效液相荧光检测法,考察不同的前处理方法对柑橘中5-甲基四氢叶酸检出结果的影响。结果表明:柑橘类样品果肉、果皮、囊衣3g,种子2g匀浆后加入20mL磷酸缓冲液,调解pH值为6.8,沸水浴处理15min(1次水解),冷却离心取上清液定容至25mL后取3mL,添加0.5mL大鼠血清、37℃振摇温育20h时,可得到最佳检测结果。

N5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与蒙古族原发性高血压病的关系

目的探讨N5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T位点突变与蒙古族高血压病患者之间的关系。方法采用Sequenom系统检测110例高血压病患者及115例健康对照组MTHFR基因多态性。结果蒙古族高血压人群MTHFR基因TT基因型频率及T等位基因频率(0.15,0.32)与正常人群(0.10,0.29)相比差异无显著性(P>0.05);单纯收缩压增高人群MTHFR基因型TT基因型及T等位基因频率(0.23,0.40)高于正常人群,差异有显著性(P<0.05)。结论MTHFR C677T位点TT基因型及T等位基因突变增加蒙古族人群单纯收缩压增高的危险性,可能是单纯收缩期高血压病的易感基因。