兔外周血间充质干细胞的体外分离培养及诱导成骨

背景:研究证明外周血中存在间充质干细胞,但含量极少。目的:拟从兔外周血中提取间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞分化。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/12在山东省立医院中心实验室完成。材料:新西兰大白兔6只,购自山东省农科院。α-MEM培养基、L-DMEM培养基为Hyclone公司产品。方法:每隔2d从兔背部不同部位切去3cm×3cm的全层皮肤(保留背部肌层),所切皮肤做原位移植后包扎,每只兔连续创伤4次。分别于创伤前及末次创伤1周后从股静脉取外周血,采用密度梯度离心法获取间充质干细胞,设立2组,分别加入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基或L-DMEM培养基。细胞传至第2代以1×105/cm2密度接种于12孔板,加入含成骨诱导剂的H-DMEM培养液进行成骨诱导。主要观察指标:创伤前后细胞形态观察,成纤维样细胞集落形成率,成骨诱导效果。结果:创伤前所获得的细胞首次换液后,未见有梭形细胞贴壁;创伤后所获得的细胞接种24h即可见有短梭形及多角形细胞贴壁,五六天后出现细胞集落。与L-DMEM培养基组比较,α-MEM培养基组外周血成纤维样细胞集落形成率明显升高(P<0.05)。外周血间充质干细胞成骨诱导后,呈梭形、三角形或多角形,有突起,可见两三个核仁和细胞分裂相,增殖速度缓慢,诱导7d后碱性磷酸酶阳性率达80%以上,诱导21d后茜素红染色形成钙结节。结论:皮肤损伤刺激后可成功从兔外周血中获取间充质干细胞,且具备成骨分化特性,α-MEM培养基较L-DMEM培养基更适合外周血间充质干细胞的体外生长。