从水稻Ac/Ds插入突变体扩增Ds侧翼序列的最适TAIL-PCR引物(英文)

温度非对称交互PCR(TAIL PCR)技术已广泛应用于从多种生物体系克隆侧翼于已知序列的DNA片段的分子操作中 ,并极大地促进了反向遗传学研究。但是 ,可能由于不同物种间基因组大小和序列存在显著差异 ,在采用该技术进行转座元件Ds水稻插入突变体鉴定过程中 ,常因TAIL PCR反应的稳定性差而影响突变体筛选效率。有鉴于此 ,根据Ds核苷酸序列设计了分别对应或互补于Ds插入元件两端长度不同的 12个特异引物组成 32个组合 ,在大量预试验基础上与 6个不同简并性 (32～ 2 5 6 )的随机简并引物分别组合进行TAIL PCR反应 ,较系统地研究了引物特性对以水稻基因组DNA为模板的TAIL PCR反应效率的影响。结果发现 ,第一反应采用长序列特异引物(36～ 4 0mer)可显著提高扩增特异性 ,随机简并引物的简并度对反应的影响显著。还选择出两个适于从水稻Ds插入突变体基因组高效扩增出Ds插入侧翼片段的最优特异引物组合和最适简并引物。应用本研究结果可显著地提高TAIL

应用改良TAIL-PCR克隆黄瓜6PGDH基因上游序列

运用改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)对黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6-phosphogluconate dehydrogenasegene,6PGDH)的上游序列进行了克隆。与最初的TAIL-PCR相比较,主要改进之处有:(1)根据Primer 5.0软件计算结果从随机RAPD引物库中筛选出合适的上游引物,低严谨和高严谨反应中的退火温度也分别进行了调整;(2)将热不对称交替反应继续应用到第3轮PCR扩增反应中以提高特异目的条带和减少非目的条带。经过3轮PCR扩增反应最终获得位于黄瓜6PGDH起始密码子ATG上游长度为517 bp新序列。试验结果表明,应用改良TAIL-PCR能快速、有效地克隆与已知区域相邻的序列。

基于转录组的3种缬草SSR位点信息比较分析

为研究3种缬草SSR分子标记的差异,开发相应的引物用于缬草的鉴定及分子育种。本研究采用Excel和MISA软件对3种缬草转录组中SSR位点数据进行分析,利用Primer 3.0软件随机设计SSR引物,并进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳验证引物的有效性和SSR的多态性。结果显示,缬草Valeriana officinalis L.(VOL)、Valeriana officinalis var.iatifolia Miq.(VOI)及Valeriana officinalis var.officinalis Linn.(VOO)的转录组数据分别包含29 462、40 840和29 280个序列总数(Unigene),这些Unigene分别包含7 515、8 046和7 330个SSR位点。3种缬草的SSR位点的发生频率为25.50%、19.71%、25.05%,平均距离为4.16 kb、4.20 kb、4.22 kb。SSR单碱基重复基元的主要类型为A/T型,占SSR总数的41.76%、41.30%、38.50%。VOL、VOI、VOO 3种缬草的独有重复基元数量分别是44种、45种、25种。随机设计的引物扩增SSR的有效率为77.78%,具有SSR高多态性的引物占比55.56%。总之,3种缬草的SSR位点具有分布密度高、出现频率高、重复基元类型多等特点,多态性好,可为3种缬草后续的鉴定及分子育种提供理论依据。

草乌头光照适应性的转录组分析

研究通过分析遮荫处理对草乌头(Aconitum kusnezoffii L.)叶片中差异表达基因的影响,揭示其响应遮荫的分子机制。通过对遮荫处理后草乌头叶片的转录组测序,发现数据质量较高(Q30≥94.37%),并通过拼接和组装得到59082个Unigenes(N50为1826 bp)。功能注释表明,有27668个Unigenes(46.83%)被注释到多个重要数据库。差异表达基因分析筛选出483个差异基因,其中421个获得注释。研究发现,光照条件显著影响草乌头的光合作用、激素调控和能量代谢等生物过程。关键基因分析显示,LHCB17,ATPβ,PetA等在遮荫下表达下调,LHCB1,GA2ox等表达上调。这些基因的调控作用揭示了光照对草乌头生长和代谢适应性的影响。实时荧光定量分析验证了转录组数据的可靠性。研究结果不仅增进了对草乌头适应光照环境的理解,还为其遗传调控网络和功能基因的研究提供了线索,对草乌头的合理栽培和利用具有重要意义。

L型滑液囊支原体实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立一种快速、灵敏的检测我国优势基因型(L型)滑液囊支原体(MS)的方法,试验针对L型MS vlh A基因核苷酸序列保守区设计引物及Taq Man-MGB探针,将PCR扩增的vlh A基因克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒vlh A-L作为阳性质粒标准品,建立实时荧光定量PCR(q PCR)方法,并检验该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示:该方法特异性良好,与C型MS-H株及其他鸡常见病原不发生交叉反应;重组质粒vlh A-L最小检出浓度为1.94×10^(1) copies/μL;组内和组间重复性变异系数均小于1%;临床样品检测结果与PCR测序结果吻合。研究表明,建立的q PCR方法特异性强、灵敏性高、重复性好,适用于检测我国L型MS感染情况,还可满足监测免疫MS-H株疫苗鸡群L型MS感染的要求。

美国引进甘蔗热带种的ARMS PCR真实性鉴定

甘蔗遗传基础狭窄已经极大地阻碍了其育种进程,挖掘优异种质资源、创新亲本材料将成为未来甘蔗育种的重要方向之一。利用四引物扩增受阻突变PCR体系(ARMS PCR)对国家甘蔗种质资源圃保存的美国引进的24份疑似热带种材料进行真实性鉴定。PCR鉴定结果表明,供试材料中有‘Green German’、‘Black Fiji’、‘Chittan’、‘IN 84-072’和‘NG 21-002’这5份材料扩增带型与热带种‘拔地拉’(Badila)一致,仅出现428 bp的共有条带和278 bp的热带种特有条带,属于热带种带型;而其它19份材料同时具有278 bp的热带种特有条带和203 bp的割手密特有条带,属于热带种与割手密的杂交种带型。经过上述分子鉴定得出结论,24份美国引进的甘蔗种质中有‘Green German’、‘Black Fiji’、‘Chittan’、‘IN 84-072’和‘NG 21-002’这5份材料为热带种材料,建议后续加强其农艺性状和抗性调查,并作为甘蔗热带种新血缘亲本进行杂交利用。

小麦过氧化氢酶基因家族的鉴定及其在逆境胁迫下的表达模式分析

植物过氧化氢酶(catalase)基因(CAT)在分解过氧化氢以及应对各种环境胁迫中发挥着重要作用。为了进一步了解过氧化氢酶基因家族成员的功能,利用生物信息学方法从普通六倍体小麦(Triticum aestivum L.)中鉴定到10个过氧化氢酶基因(TaCATs),对其系统发育关系、蛋白质特征、染色体分布、基因结构、顺式元件和转录组进行了初步分析。采用qRT-PCR技术分析了小麦CAT基因在激素类胁迫、干旱胁迫和盐胁迫等胁迫下的的表达模式,并采用马铃薯晚疫病致病疫霉(Phytophthora infestans)对瞬时过表达的TaCAT3和TaCAT4烟草叶片进行抗疫霉侵染能力分析。结果表明,激素类顺式元件中数量最多的是参与脱落酸反应的顺式元件,其中TaCAT4所包含的顺式作用元件中参与激素类反应的元件最多。转录组数据表明,在小麦的不同生长发育时期、生物胁迫和非生物胁迫中,TaCATs在生物胁迫下的表达水平要高于其他2类,其中TaCAT4在白粉菌和禾谷镰刀菌胁迫下的表达量均高于对照。qRT-PCR结果表明,TaCATs在激素类胁迫中的表达量最高,其次是PEG胁迫。其中TaCAT8在ABA胁迫下2 h的表达量为0 h的250倍以上,TaCAT6在PEG胁迫下72 h的表达量接近0 h的40倍。疫霉侵染结果表明,经过瞬时过表达的TaCAT3和TaCAT4的叶片病变面积明显小于对照组。这些结果表明外界胁迫可以提高小麦CAT基因的表达,通过减少过氧化氢的过度积累来减少逆境胁迫对植物造成的危害,从而提高植物的抗逆境胁迫能力,进一步充分证明了TaCATs在小麦抵御非生物和生物胁迫中起着重要作用。

基于实时荧光定量PCR的番木瓜多重PCR高效检测方法

以pCaMV35S基因核酸检测试剂盒反应体系为基础,添加多重PCR反应所需的目标基因引物和番木瓜(Carica papaya L.)DNA,进行多重PCR反应,同时考察不合成荧光探针的情况下对目标基因进行实时荧光定量检测。结果表明,在实时荧光定量PCR反应体系中,多重PCR扩增的基因条带比常规PCR扩增的基因条带更亮,在不合成荧光探针的情况下实现目标基因的实时荧光定量PCR反应,以期建立一种基于实时荧光定量PCR的多重PCR检测方法。

基于e-PCR的小麦、山羊草属SSR电子指纹图谱的开发

电子指纹图谱的绘制可对电泳结果进行规范化、可视化操作,进而提高小麦分子标记的流通性,加速小麦育种进程。本研究用MicroSAtellite(MISA)软件对小麦属、山羊草属共61个叶绿体和13个线粒体的全基因组SSR标记进行搜索,发现SSR位点的出现频率与基因组类型有关,线粒体、叶绿体基因组均以2次重复的五核苷酸和六核苷酸重复基序为主,同一种类型的基序重复次数与SSR数目成反比;基于电子PCR技术(e-PCR)并结合MapChart软件共筛选出30对引物,其中来源于二倍体和四倍体山羊草属叶绿体全基因组的引物分别有16和2对,来源于四倍体和六倍体小麦属叶绿体全基因组的引物分别有5和2对,来源于六倍体小麦属线粒体全基因组的引物有5对,最后用MapChart软件绘制电子指纹图谱。本研究采用了一种新的SSR引物设计和筛选方法,完成了小麦属、山羊草属叶绿体和线粒体共74个全基因组序列SSR分子标记的初步开发和电子指纹图谱的绘制,为引物开发提供了新思路,有利于提高分子标记的流通性以及小麦种质资源亲缘关系的鉴定。

工业大麻种子萌发及渗透胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选适用于工业大麻种子正常萌发与渗透胁迫下萌发的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)内参基因,研究以‘云麻7号’种子为试验材料,设置正常萌发和20%PEG渗透胁迫下萌发处理.利用qRT-PCR技术对10个候选参考基因(CDPK,eIF4E,TIP41,UBQ,EF1α,PP2A,Actin,Clathrin,TUB,DHS2)在3个萌发时间点(萌发3、5、7 d)幼苗中的表达量进行检测.通过GeNorm、Normfinder和BestKeeper三种软件包对内参基因表达稳定性进行评价,再利用RefFinder在线软件进行综合分析,从而获得稳定、适宜的内参基因.结果表明,在工业大麻种子正常萌发过程中,PP2A基因的稳定性最好.在渗透胁迫下的种子萌发中,UBQ基因的稳定性最好.综合两组结果得出,eIF4E内参基因的表达最稳定.研究结果确定了工业大麻种子萌发及渗透胁迫下进行qRT-PCR分析的最适内参基因,为今后研究工业大麻种子萌发响应渗透胁迫相关基因的表达提供前期基础.

云香水仙WD40基因克隆及序列分析

目的探讨云香水仙WD40基因在花色形成中的作用。方法基于前期的转录组数据,以云香水仙为材料,采用RT-PCR技术对WD40基因进行克隆,并结合Real-time PCR检测其在不同花期的表达水平。结果克隆得到1个WD40基因,命名为NtWD40,开放阅读框长为1020 bp,共编码339个氨基酸。同源性分析表明,云香水仙与拟南芥、苹果、矮牵牛及苜蓿的相似系数分别为68%、68%、68%和69%。Real-time PCR分析表明:始花期NtWD40的表达量较其他花期有明显差异。结论NtWD40可能参与云香水仙类黄酮途径相关色素的合成。

苜蓿矮化病毒实时荧光定量PCR检测体系的建立

为灵敏、快速检测紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中的苜蓿矮化病毒(ADV),根据该病毒L蛋白保守序列设计特异性引物,建立基于SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量PCR检测体系,并应用该方法对田间样品和种子进行快速检测。结果表明,建立的RT-qPCR检测技术可对苜蓿中的苜蓿矮化病毒含量进行精确检测,最低检测浓度为9.8×10^(2)copies/μL,灵敏度约是常规PCR的100倍。通过对101份苜蓿样品的检测验证,该方法阳性检出率为61%,较常规PCR高6%。挑选的10份苜蓿种子中有3份被检测出携带苜蓿矮化病毒,病毒含量范围为0~3.02×10^(6)copies/μL。表明建立的RT-qPCR检测体系特异性强、灵敏度高,可应用于苜蓿矮化病毒的定量检测。

Mutator诱导的玉米白化突变体插入位点的遗传分析及代谢途径的构建

【目的】利用Mutator(Mu)诱变群体获得、验证叶色白化突变体的Mu因子插入位点;解析玉米叶色变异相关基因及其代谢网络。【方法】以含有活性MuDR转座子的W22∷Mu为父本,与玉米自交系综31(Z31)杂交产生的M2和M3家系群体为材料,经表型性状的遗传分析和Mu插入位点的分离获得白化突变体,经生物信息学方法解析白化突变体产生的相关基因,同时构建产生白化突变代谢网络。【结果】对870个M2家系的16000余单株和M3种植的36个家系近700单株进行考察,获得了遗传稳定的白化突变体41株。经Mu-TAIL-PCR分析获得35条Mu因子插入序列;对靶位点序列分析,获得的14个靶位点可能与叶绿素合成及光合作用有关;利用其中6个靶位点构建了5条玉米叶色突变产生白化的叶绿素代谢网络途径。【结论】初步证实了Mu转座子插入的27个靶位点与叶色白化突变体的关联;建立了6个靶位点的玉米叶色突变产生白化的叶绿素代谢网络途径。

郁金香不同组织内参基因筛选及稳定表达分析

【目的】筛选郁金香在盐胁迫条件下稳定表达的内参基因,为开展郁金香耐盐相关基因表达调控相关研究提供理论参考。【方法】以郁金香栽培品种红色印象为材料,于苗期对其进行盐胁迫处理,不同时间(0、2、4、6、8、10、12、24和48 h)采集根、鳞茎和叶,通过实时荧光定量PCR检测候选内参基因在郁金香不同组织中的表达情况,再利用Delta CT计算每个样本的平均C_(t)值,再结合3个常用内参基因稳定性评估软件(geNorm、NormFinder、BestKeeper)的分析结果,利用RefFinder在线软件综合评价候选内参基因的表达稳定性,并通过目的基因质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(SOS1)和液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(NHX1)的表达分析验证内参基因的可靠性。【结果】在15个候选内参基因中筛选到9个可用于郁金香各组织实时荧光定量PCR的内参基因。候选内参基因的C_(t)值分析结果显示,25S rRNA在不同组织中的平均C_(t)值最低,表达丰度最高,C_(t)值分布范围相对集中,是根、鳞茎和叶均能稳定表达的内参基因。geNorm和NormFinder分析结果均显示,18S rRNA均能在根、鳞茎和叶中稳定表达,25S rRNA在根和叶中表现出较好的基因稳定性,NADP基因在鳞茎中基因稳定性较好。BestKeeper分析结果显示,根、鳞茎和叶组织中最佳的内参基因为25S rRNA,同时18S rRNA在根和叶中稳定性较好。结合上述4种分析结果通过RefFinder软件得到各候选基因在郁金香不同组织中的表达稳定性综合排名,其中根组织:25SrRNA>18SrRNA>TUB-6>EF1α>NADP>EF-1α>β-actin;鳞茎组织:NADP>25S rRNA>18S rRNA>EF-1α>EF1α>TUB-6;叶组织:25S rRNA>18S rRNA>EF-1α>CYP>UBC。【结论】9个候选内参基因在郁金香不同组织中的表达情况存在差异,25S rRNA和18S rRNA是在郁金香各组织的不同盐胁迫处理中稳定表达的内参基因,同时使用2个内参基因更有利于得到准确的基因表达定量结果。

褐飞虱卵黄原蛋白基因NlVg1的克隆及表达分析

目的:卵黄原蛋白是昆虫卵黄磷蛋白的前体,也是卵母细胞成熟和胚胎发育阶段最为重要的生殖蛋白。本文研究褐飞虱Nilaparvata lugens St?l卵黄原蛋白基因的表达规律,旨在为筛选害虫防治靶标及敏感期提供线索。方法:根据褐飞虱转录组测序信息,对预测编码卵黄原蛋白的Unigene 40792序列(NlVg1)进行了克隆,应用实时荧光定量PCR技术对NlVg1在褐飞虱不同发育时期以及不同水稻品种上的表达规律进行了研究。结果:克隆的NlVg1开放阅读框长1 212 bp,编码的蛋白含403个氨基酸残基。通过对转录水平的表达分析发现,NlVg1在褐飞虱1~4龄若虫期不表达,从5龄开始有少量表达,在羽化3 d的成虫时期表达量最高;在抗性水稻品种的表达量低于感性品种。结论:本研究克隆了褐飞虱的1个卵黄原蛋白相关基因NlVg1的全长cDNA开放阅读框,对其编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析,并通过荧光定量PCR技术对褐飞虱在不同发育时期以及不同水稻品种饲养条件下的该基因的表达规律进行研究。研究结果为后期选择合适的时期对目的基因进行RNAi等功能研究提供了线索。

草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟

以来源于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的酪氨酸酚裂解酶(Eh-TPL)为目的基因,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,利用高通量筛选方法获得了比酶活提高的突变体S20C和E202R,再通过定点突变得到突变体S20C/E202R/N161S。经摇瓶发酵培养发现,突变体S20C/E202R/N161S比野生型Eh-TPL的比酶活提高了30.61%;酶学性质研究结果表明,突变体S20C/E202R/N161S的最适温度仍为37℃,最适pH值从8.2升至8.5,热稳定性、pH稳定性均得到明显提高;结构模拟结果表明,突变体S20C/E202R/N161S的三维结构无明显变化,突变位点附近氢键和表面电势有所变化。体外定向进化技术能有效提高Eh-TPL的催化效率,对酶法生产L-酪氨酸具有重要应用价值。

辣椒SRAP-PCR反应体系的建立与优化

SRAP标记(Sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)是由Li和Quiros发展了一种新的分子标记技术。SRAP标记具有简便、稳定、中等产率、在基因组中分布均匀的特点,已经应用于在水稻、棉花、油菜、马铃薯、苹果、柑橘类果树、樱桃、梅子、大蒜、莴苣及芹菜等植物和水稻稻瘟病的研究中,对开展遗传图谱构建、基因定位与克隆、比较基因组学、cDNA指纹图谱、生物多样性研究、预测杂种优势等研究是一个十分实用的工具。本研究对辣椒SRAP反应体系的程序、模板、Mg2+等参数进行优化研究,结果表明:辣椒的PCR程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5循环,94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,35循环,最后72℃延伸10min;25滋l反应体系中,模板量为15ng,Mg2+为2.0mmol/L。本研究建立的辣椒SRAP体系重复性好、稳定性强。

水稻花粉特异性启动子的克隆与表达

利用PCR技术 ,从水稻幼苗总DNA中扩增并克隆了一段DNA片段 .将该片段与报告基因GUS基因融合 ,构成植物表达载体 .经农杆菌转化烟草萌发花粉 ,共培养约 2 4h后 ,作瞬时表达检测 .结果表明 ,该克隆片段具有启动子功能 .DNA序列分析表明 ,该克隆片段长度为 5 2 6bp ,含有TATA盒及CAAT盒 .与原基因(PSI)启动子序列比较 ,同源性为 5 2 % 。

辣椒RAPD系统的建立及在杂种纯度鉴定中的应用

对辣椒RAPD反应的各个环节 ,包括DNA提取、PCR反应和电泳检测进行了筛选和优化 ,确定了一个简单、高效、相对稳定的RAPD系统 ,并筛选出 12个较稳定的RAPD标记。可以用于“中椒”系列辣椒的 9个杂交种的纯度鉴定。

龙眼SCoT-PCR反应体系的优化

目标起始密码子多态（start condon tardeted polymorphism,SCoT）分子标记结合了ISSR标记和RAPD标记的优点,具有操作简单﹑成本低廉﹑多态性丰富﹑重复性好﹑引物设计简单且通用性良好等诸多优点。本实验以石硖龙眼的新鲜叶片为试材,采用单因素试验的方法分别研究模版、引物、rTaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液（Mg2＋）及退火温度共6因素各8个水平对龙眼SCoT-PCR扩增结果的影响。结果表明：龙眼SCoT标记的20μL优化反应体系为：10×BufferⅡ（含Mg2＋）2.0μL、DNA模板30ng、引物浓度为30μmol/L、rTaqD-NA聚合酶用量为0.45U、dNTP浓度为4.0mmol/L。适宜的扩增程序为：94℃预变性4min;95℃变性50s,49.5℃退火40s,72℃复性2min,36个循环;最后72℃延伸10min。利用24个龙眼品种验证该反应体系,1.5%琼脂糖电泳检测结果显示,扩增产物在400-2200bp之间,不同品种间DNA谱带具有多态性,反应体系具有良好的稳定性和可重复性。