RD、Hep-2、L20B细胞用于脊髓灰质炎病毒学监测的实验研究

目的 :观察 RD、Hep- 2和 L 2 0 B用于脊髓灰质炎病毒学常规监测的实验结果 ,提高脊髓灰质炎病毒的检出率。方法:对 RD、Hep- 2和 L2 0 B用于脊髓灰质炎病毒监测进行了实验研究。用细胞培养法进行病毒分离。结果 :L2 0 B细胞对脊髓灰质炎病毒具有较强的敏感性和特异性 ,但非脊髓灰质炎肠道病毒 (NPEV)在 RD细胞上呈选择性增值 ,可能会造成 NPEV检出率下降。 结论:RD、Hep- 2和 L2 0

L20B细胞吸附法用于环境水中病毒的分离培养

目的 :建立一种用于检测外环境水中脊髓灰质炎病毒的方法。方法 :细胞吸附浓集法 :将自然沉清的水样抗菌、等渗处理后 ,加入适量的 L 2 0 B细胞 ,混匀 ,充分吸收水中的脊髓灰质炎病毒 ,然后收集细胞培养、分离病毒。同时用 Al Cl3- Na Cl沉淀法浓集病毒 ,接种 L2 0 B细胞分离病毒 ,作为对照。结果 :4 0份水样 ,用 L2 0 B细胞吸附法检出10株脊髓灰质炎病毒 ,用 Al Cl3- Na Cl沉淀法未检出脊髓灰质炎病毒。结论 :新建立的细胞吸附浓集法可用于外环境水中的脊髓灰质炎病毒的检测 ,且检测的敏感性明显高于 Al Cl3- Na Cl沉淀法。

水样中脊髓灰质炎病毒检测方法的实验研究

目的:探索灵敏、简便、实用的检测水样中微量脊髓灰质炎病毒(脊灰病毒)的方法.方法:将L20B细胞加入含微量脊灰病毒的水样中,充分作用后收集细胞,作病毒分离培养,并以NaCl-AlCl3沉淀法作对照.结果:应用活的L20B细胞时,1 000 ml水样中含病毒100TCID50、10TCID50时能全部检出;当含1～2TCID50时14份样本可检出13份.NaCl-AlCl3沉淀法在100TCID50时4份样本中仅检出1 份,其他各浓度的4份样未能检出;应用固相化的L20B细胞处理污水时,2～3×106个细胞,甲醛固定4 h和48 h以上的细胞吸附的病毒量,均值都是18.1TCID50,用细胞吸附浓集法,在40份自然水样中,10份检出脊灰病毒,而NaCl-AlCl3沉淀法未能检出脊灰病毒.结论:应用活细胞吸附时敏感度达到1～2TCID50/1 000ml;应用甲醛固定的细胞吸附污水中病毒时敏感度可达到10 TCID50/1 000ml.

细胞吸附浓集法分离水中微量脊髓灰质炎病毒的实验研究

目的 :建立一种简便、实用的检测大量水样中的微量病毒的方法。方法 :将 L 2 0 B细胞加入大量的含微量脊髓灰质炎病毒的水中 ,充分作用后收集细胞 ,作病毒的分离培养。同时以 Na Cl— Al Cl3沉淀法作对照。结果 :10 0 0 ml水样中含病毒 10 0、10 TCD5 0时能全部检出 ;当含 1— 2 TCD5 0 时 14份样本可检出 13份。 Na Cl— Al Cl3沉淀法 :在 10 0 TCD5 0 时 4份样本中仅检出 1份 ,其它各浓度的 4份样都未能检出。结论 :细胞吸附浓集法分离水中病毒敏感、实用。

外环境中脊髓灰质炎病毒分离的实验研究

［目的］建立一种简便、实用的检测大量水样中的微量脊髓灰质炎病毒的方法。［方法］将Ｌ２０Ｂ细胞 加入大量的含微量脊髓灰质炎病毒的水中，充分作用后收集细胞，作病毒分离培养。同时以 ＮａＣ１—Ａ１Ｃ１_３沉淀法作对照。 ［结果］１０００ｍｌ水样中含病毒１００、１０ＴＣＤ_５０时能全部检出：当合１～２ＴＣＤ_５０时１４份样本可检出１３份。ＮＳＣ１—Ａ１Ｃ１_３ 沉淀法在１００ＴＣＤ_５０时４份样本中仅检出１份，其它各浓度的４份样都未能检出。

外环境中脊髓灰质炎病毒分离的实验研究

建立一种简便、实用的检测大量水样中的微量脊髓灰质炎病毒的方法。这种方法是将L2 0B细胞加入大量的含微量脊髓灰质炎病毒的水中 ,充分作用后收集细胞 ,作病毒分离培养。同时以NaCl-AlCl3 沉淀法作对照。结果表明 ,10 0 0ml水样中含病毒 10 0、10TCD50 时能全部检出 ;当含1～ 2TCD50 时 14份样本可检出 13份。NaCl-AlCl3 沉淀法在 10 0TCD50 时 4份样本中仅检出 1份 ,其它各浓度的 4份样都未能检出。

固相化细胞吸附浓集法分离污水中脊髓灰质炎病毒的实验研究

〔目的〕建立一个适用于污水中脊髓灰质炎病毒分离培养的方法。〔方法〕采用固相化的L2 0B细胞吸附法 ,浓集污水中的脊髓灰质炎病毒 ,将浓集物再用活的L2 0B细胞培养。〔结果〕能够检出 10 0 0ml水中的 0 .1～ 10TCID50 量的脊髓灰质炎病毒 ,在10 0 0ml预处理后的污水中加入 10TCID50 量的病毒 ,亦可以检出。〔结论〕本方法的有效检出限为 10TCID50 / 10 0 0ml,可用于污水中的脊髓灰质炎病毒的浓集和分离培养。

细胞吸附浓集法分离外环境水中脊髓灰质炎病毒

〔目的〕建立一种用于检测外环境水中脊髓灰质炎病毒的方法。〔方法〕细胞吸附浓集法 :将自然沉清的水样抗菌、等渗处理后 ,加入适量的L2 0B细胞 ,混匀 ,充分吸收水中的脊髓灰质炎病毒 ,然后收集细胞培养、分离病毒。同时用AlCl3 -NaCl沉淀法浓集病毒 ,接种L2 0B细胞分离病毒 ,作为对照。〔结果〕40份水样 ,用L2 0B细胞吸附法检出 10株脊髓灰质炎病毒 ,用AlCl3 -NaCl沉淀法未检出脊髓灰质炎病毒。〔结论〕新建立的细胞吸附浓集法可用于外环境水中的脊髓灰质炎病毒的检测 ,且检测的敏感性明显高于AlCl3 -NaCl沉淀法。

5株在L20B细胞复制的非脊髓灰质炎肠道病毒的鉴定及基因特征分析

目的鉴定L20B细胞[转人脊髓灰质炎(脊灰)病毒受体基因的小鼠肺细胞系]支持生长的非脊灰肠道病毒(Non-polio Enteroviruses,NPEV)的血清型,并分析病毒基因特征,探讨其对脊灰病毒(Poliovirus,PV)分离率的影响。方法收集宁夏回族自治区从健康人群和广西壮族自治区从急性弛缓性麻痹病例粪便标本中分离的5株L20B细胞支持生长的NPEVs,对病毒分离物采用逆转录-聚合酶链反应进行VP4编码区基因扩增和核苷酸序列测定和分析,根据序列比对结果确定血清型,再进行全长VP1编码区序列测定和分析,并和基因数据库下载的相应血清型NPEVs的VP1编码区核苷酸序列进行比对和分析,构建基因亲缘性关系树。结果 5株NPEVs均鉴定为柯萨奇A组病毒(Coxsackie Virus GroupA,CVA),其中1株为CVA4,另1株为CVA8,其余3株均为CVA10,均属A组人肠道病毒(Human Enteroviruses,HEV);通过比较全长VP1编码区核苷酸同源性和构建亲缘关系树发现,3个血清型的中国分离株都分别独立成簇,与其他国家分离的相应血清型的NPEVs及原型株病毒差异都较大,是本土流行病毒株。结论所研究的L20B细胞支持生长的5株NPEVs均属A组HEV,包括CVA4、CVA8、CVA10三个血清型。由于L20B细胞对PV的最初接种具有很高的敏感性,因此L20B细胞即使支持某些CVA生长,也不会影响PV分离率。但在近年来中国发生较大规模手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)的背景下,由于这些A组HEV同时是HFMD的病原体,对这些病毒的鉴定对PV的鉴别诊断和HFMD的预防控制都有实际意义。

L20B细胞在脊髓灰质炎病毒分离鉴定中的应用

在脊髓灰质炎（脊灰）病毒分离鉴定中，细胞的选择非常重要，以往世界卫生组织（ＷＨＯ）推荐使用Ｈｅｐ－２和ＲＤ两种细胞同时进行脊灰病毒的分离鉴定。由于这两种细胞不仅对脊灰病毒敏感，对非脊灰肠道病毒（ＮＰＥＶ）同样敏感，分离到许多ＮＰＥＶ。最近ＷＨＯ推荐了一种新型的对脊灰病毒特异的Ｌ２０Ｂ细胞，我们使用这种细胞进行的实验显示。

三种细胞在脊髓灰质炎病毒检测中的应用比较

为了比较在常规应用条件下L2 0B细胞与RD、Hep 2细胞对脊髓灰质炎 (脊灰 )病毒 (PV)的敏感性和选择性 ,同时用 3种细胞检测急性弛缓性麻痹 (AFP)病例 412份粪便标本 ,进行PV分离鉴定及效价测定。结果表明 ,L2 0B细胞对PV更敏感 ,对PV有完全的选择性和良好的特异性 ,对同时混有非脊灰肠道病毒 (NPEV)和PV的粪便标本 ,L2 0B细胞能更快地检测出PV ,而RD、Hep 2细胞被NPEV的生长所掩盖。L2 0B细胞的PV检出率 (5 34 % )高于RD(4 6 1% )、Hep 2细胞 (2 6 7% )。L2 0B、RD、Hep 2细胞对PV的敏感性分别为 88%、76 %、44 % ,但 3种细胞对PV都出现了不同程度的漏检。从 2 5株PV效价滴定结果分析 ,3种细胞对PV的滴度均为L2 0B、RD细胞高于Hep 2细胞。表明L2 0B细胞能简化粪便标本PV检测过程。它的应用对PV分离不失为一种便捷、省时、省力、经济和可靠的方法。

黑龙江省2014—2018年脊髓灰质炎病毒实验室细胞系质量监测分析

目的通过对黑龙江省脊髓灰质炎病毒实验室使用的L20B和RD细胞系在2014—2018年进行连续的细胞支原体和敏感性监测,并对监测结果进行分析,保障脊髓灰质炎病毒实验室检测的准确性。方法使用巢式聚合酶链反应方法检测细胞支原体污染;使用96孔微量板滴定法在两种细胞系上对3个型别的脊髓灰质炎病毒敏感性进行检测。结果监测期间两种细胞系支原体检测均为阴性,L20B细胞对3个型别的脊髓灰质炎病毒敏感性结果分别为6.78±0.23、6.82±0.11和6.79±0.21,RD细胞分别为8.17±0.27、8.13±0.34和8.13±0.28。结果均在正常范围内波动。结论 2014—2018年黑龙江省脊髓灰质炎病毒实验室所使用的两种细胞系状态稳定,对3个型别的脊髓灰质炎病毒保持高度敏感,为脊髓灰质炎病毒的分离鉴定工作提供了可靠的保障。

二代测序技术在用于脊髓灰质炎病毒分离的细胞系交叉污染鉴定中的应用

目的应用二代测序(Next generation sequencing,NGS)技术鉴定用于脊髓灰质炎(脊灰)病毒分离的RD和L20B细胞种属来源,以判断细胞间是否存在交叉污染。方法选用新复苏的RD和L20B细胞作为对照组,传代多代的RD和L20B细胞作为实验组,观察在接种两种非脊灰肠道病毒株后的细胞形态和细胞病变(Cytopathic effect,CPE),检测细胞的支原体和细胞对脊灰病毒的敏感性;利用NGS技术对细胞进行高通量测序和比对,以鉴定细胞的种属来源、识别交叉污染。结果与对照组RD细胞相比,实验组RD细胞形态出现膨胀、条柱形等变化,实验组L20B细胞形态相似;接种两种非脊灰肠道病毒毒株后,对照组RD细胞发生CPE而L20B细胞未发生CPE,实验组两种细胞均发生CPE。对照组和实验组两种细胞支原体检测均阴性,且敏感性结果均处于正常范围内。经NGS技术鉴定,实验组RD和L20B细胞均属于人源细胞,L20B细胞的种属来源与预期不符。结论实验组RD和L20B细胞间存在交叉污染;NGS技术能够快速、准确、全面地鉴定细胞系的种属来源,及时识别细胞间交叉污染,可进一步推动脊灰病毒分离用细胞系质量控制工作。