雌马酚通过调控自噬干预棕榈酸诱导的L6细胞肌管萎缩

目的观察雌马酚(equol,Eq)干预对棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的L6大鼠成肌细胞肌管萎缩的影响,并探讨其机制。方法体外培养L6细胞,以不同浓度的Eq、PA处理24 h,通过CCK-8法检测相对细胞活力确定Eq、PA干预的适宜浓度。将细胞分为对照组、模型组(PA:0.25 mmol/L)、干预组(PA:0.25 mmol/L+Eq:1μmol/L)和自噬抑制剂组(PA:0.25 mmol/L+Eq:1μmol/L+3-MA:1 mmol/L)。干预24 h后检测各组细胞葡萄糖摄取能力;HE染色观察细胞肌管生长情况;透射电镜观察细胞自噬小体数量;激光共聚焦显微镜观察经线粒体荧光探针标记的线粒体形态;Western blot检测MyHC、p62蛋白、LC3蛋白、MFN2和DRP1表达水平。结果干预24 h后,与对照组比较,模型组L6细胞葡萄糖消耗明显减低(P<0.05),肌管直径明显减小(P<0.05),自噬小体数量减少,线粒体裂变增加,MyHC、MFN2蛋白表达水平降低(P<0.05),而p62、DRP1表达水平及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值增加(P<0.05);与模型组相比,干预组L6细胞葡萄糖消耗明显增加(P<0.05),肌管直径明显增大(P<0.05),自噬小体数量增加,线粒体裂变减少,MyHC、MFN2蛋白表达水平升高(P<0.05),而p62、DRP1表达水平及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低(P<0.05);Eq对PA诱导的L6细胞葡萄糖消耗,肌管直径,自噬小体数量,线粒体裂变,MyHC、p62、MFN2、DRP1蛋白表达水平及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值的影响可被3-MA有效抑制。结论Eq可有效改善PA诱导的L6细胞肌管萎缩,其部分机制与Eq通过促进自噬,减轻线粒体裂变有关。

棕榈酸致大鼠L6肌细胞胰岛素抵抗与JNK1活化的关系

目的建立棕榈酸(PA)诱导的大鼠L6肌细胞胰岛素抵抗模型,初步探讨其机制与C-jun氨基末端激酶1(JNK1)活化的关系。方法不同浓度PA分别培养已分化的L6肌细胞2、4、8、12、24、36 h,用葡萄糖试剂盒分别检测各组培养液中剩余葡萄糖浓度,观察不同浓度PA对骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响。MTT法检测棕榈酸对L6细胞活性的影响。建立L6肌细胞胰岛素抵抗模型,Western blot检测正常组(NG组)和胰岛素抵抗组(IR组)的JNK1和p-JNK1的蛋白表达水平。结果 0.4 mmol/L的PA孵育24～36 h与0.6、0.8 mmol/L的PA孵育8～24 h后细胞上清液葡萄糖浓度明显高于NG组(P<0.05),MTT结果显示0.8、1.0 mmol/L的PA作用24、36 h时对细胞的活性有影响。Western blot结果显示:NG组JNK1和p-JNK1的表达量较低,IR组JNK1和p-JNK1的表达量上升,其中p-JNK1表达量上升较JNK1明显,但与NG组比较,IR组的JNK1表达差异无统计学意义,p-JNK1、p-JNK1/JNK1表达差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过一定浓度和时间的PA刺激可导致大鼠L6成肌细胞胰岛素抵抗的形成,其机制可能和JNK1的活化有一定关系。

活性氧促使L6成肌细胞的分化

目的探讨氧化应激对L6成肌细胞生长分化的影响。方法MTT法检测H2O2对L6细胞活力的影响;观察H2O2引起的细胞形态学变化,RT-PCR检测myogenin基因表达水平。结果在较短的处理时间内(1h),低浓度的活性氧(50μmol/LH2O2)有利于细胞的生长(P<0.05);H2O2处理12h后,50和150μmol/L的H2O2能够诱导成肌细胞分化的标记分子-myogenin基因的表达,形态学研究结果表明H2O2能够诱导肌管的形成,促使成肌细胞的分化。结论活性氧可能是细胞内诱导细胞生长与分化的信号分子。

羊胎盘肽对L6成肌细胞增殖能力和ATP浓度的影响

[目的]将羊胎盘肽粗品按照不同的分子量段进行划分,计算出不同分段的分子量分布,研究不同分子量段的羊胎盘肽对大鼠L6骨骼肌成肌细胞增殖能力和三磷酸腺苷(ATP(浓度的影响。[方法]采用凝胶过滤色谱法,将羊胎盘肽粗品进行分离,划分为不同的分子量段,以噻坐蓝(MTT)比色法检测不同分段羊胎盘肽对大鼠L6骨骼肌成肌细胞增殖的影响,并且采用增强型ATP检测试剂盒检测其对L6成肌细胞的ATP含量的影响。[结果]凝胶过滤色谱法分离羊胎盘肽划分为六段,其中F5、F6已不属于多肽或者氨基酸,故去除。MTT结果显示SPP(羊胎盘肽粗品)、F1、F2、F3均对大鼠L6骨骼肌成肌细胞增殖出现促进作用,其中羊胎盘中的组分F3促增殖作用最为显著;F4则出现轻微抑制的作用。最终确定除F3选用5μg/mL以外,其他各组均选用20μg/mL的加药浓度进行ATP浓度的检测。经过ATP实验,SPP和F3显著性促进骨骼肌成肌细胞的ATP浓度的升高(P<0.01),并且F3比SPP效果更好。而F1、F2和F4则促进ATP产生的作用并不显著。[结论] SPP以及其中的的F1、F2、F3、F4对于L6骨骼肌成肌细胞增殖能力的影响和ATP浓度的影响较为一致。其中,F3很可能是羊胎盘肽中的活性最好的部分,即分子量在260～89Da的部分。

核糖体蛋白L6对K562/A02细胞耐药性及凋亡的影响

本研究观察核糖体蛋白L6(RPL6)基因表达的改变对白血病细胞耐药性的作用及其可能的机制。通过RT-PCR方法获得RPL6 cDNA序列,用真核表达载体pcDNA3.1(+)分别构建正向插入和反向插入的RPL6 cDNA重组质粒。以脂质体将正义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562/AO2细胞。以MTT、流式细胞术和荧光分光光度计观察RPL6对化疗药物耐药性、凋亡和caspase-3的作用。结果表明:转染正义RPL6 cDNA真核表达质粒后,K562细胞对阿霉素的耐药性增强到原来的325%,凋亡和caspase-3活性明显降低(P<0.005);转染反义RPL6 cDNA真核表达质粒后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药性降低原来的38%;凋亡和caspase-3活性明显增加(P<0.005)。结论:RPL6基因过表达通过改变药物诱导的凋亡在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用。

connexin43基因体外转染大鼠L6骨骼肌成肌细胞的研究

目的将含有connexin 43基因的质粒在脂质体的介导下转染进入大鼠L6骨骼肌成肌细胞,使用G418根据有限稀释法筛选单克隆细胞株L6myoblast-Cx43。方法通过免疫细胞化学技术、Western blot技术,对整合有connexin43基因的阳性细胞克隆进行检测。结果两个阳性克隆组Cx43蛋白表达均明显高于对照组。结论获得的两个持续高表达connexin43蛋白的细胞株可用于进行移植细胞之间及移植细胞与宿主细胞之间能否形成良好的电偶联的研究。

siRNA靶向抑制RP L6基因表达对人宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)靶向抑制核糖体蛋白L6(RPL6)基因表达对人宫颈癌He La细胞增殖及凋亡的影响。方法优化siRNA转染条件,将2条靶向抑制RPL6基因的siRNA载体片段(siRPL6-1、siRPL6-2)分别高效转染人宫颈癌He La细胞(抑制组),同时设转染无义序列(si Control)的空转染组及不进行任何处理的对照组。分别于转染24、48、72、96 h后采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测RPL6表达水平以筛选抑制率高的siRPL6载体用于后续实验。噻唑蓝比色(MTT)法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染48、96 h后的细胞凋亡和细胞周期情况,Western blotting检测各组转染96 h后的cyclin A、CDK2和p21CIP1表达情况。结果抑制组的RPL6 mRNA水平均低于空转染组和对照组(P<0.05),siRPL6-2片段的干扰效率高于siRPL6-1,故后续实验选择siRPL6-2片段;与其余两组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及caspase-3活化率均升高,且G0/G1期细胞比例升高,但S期和G2/M期细胞比例均降低,以上差异均有统计学意义(P<0.05);抑制组转染后的p21CIP1水平升高,cyclin A和CDK2水平降低,与空转染组和对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。空转染组和对照组以上指标的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论通过siRNA抑制RPL6基因表达可抑制增殖并诱导凋亡和细胞周期阻滞,对宫颈癌防治有一定价值。

人核糖体蛋白L6对白血病K562/A02细胞耐药性的影响

目的观察核糖体蛋白L6(RPL6)表达的改变对白血病耐药性的作用。方法通过RT-PCR方法获得RPL6cDNA序列,用真核表达载体pcDNA3.1(+)分别构建正向插入和反向插入的RPL6cDNA重组质粒。以脂质体将正义RPL6cDNA真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6cDNA真核表达质粒转染K562/A02细胞,以MTT观察其对化疗药物耐药性的作用。结果转染正义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562细胞对阿霉素的耐药性比未转染的K562细胞增强3.25倍,转染反义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药性比未转染的K562/A02细胞降低62%。结论RPL6基因过表达在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用。

L6细胞复合培养中平行结构支架材料的细胞黏附性观察

目的:检测在L6细胞培养过程中,具有平行结构支架材料的生物相容性。方法:将医用可吸收缝线平行折叠并制备成类似圆柱体样,与大鼠L6成肌细胞株体外复合培养。利用扫描电镜观察平行结构支架材料吸附的L6细胞的形态学结构,观察L6细胞在材料上的表面相容性。结果1天后,细胞在支架材料表面黏附、伸展,随时间的延长,显示出沿支架材料纵轴排列趋势,第6天的时候,可以见到类似肌小管的结构。结论:所制备的具有平行结构的支架材料具有良好的生物相容性。

K562/A02细胞核糖体蛋白L6的表达与多药耐药性的实验研究

目的观察核糖体蛋白L6(RPL6)基因表达的改变对白血病多药耐药性的作用。方法通过RT-PCR方法获得RPL6cDNA序列,用真核表达载体pcDNA3.1(+)分别构建正向插入和反向插入的RPL6cDNA重组质粒,以脂质体将正义RPL6cDNA真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6cDNA真核表达质粒转染K562/A02细胞,以MTT法检测细胞对阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、米托蒽醌(MIT)和依托泊苷(VP16)耐药性的作用。结果RPL6在K562/A02细胞中的表达较K562增高(P<0.001),转染正义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562细胞对ADM、VCR、MIT、VP16的耐药性比未转染的K562细胞分别增强3.25、1.95、2.00和3.48倍(P<0.05或0.01),转染反义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562/A02细胞对ADM、VCR、MIT、VP16的耐药性比未转染的K562/A02细胞分别降低62%、50%、56%和47%(P<0.05或0.01)。结论RPL6基因过表达在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用。

靶向四次跨膜L6家族成员1通路抑制三阴性乳腺癌干细胞自我更新的研究

目的研究四次跨膜L6家族成员1 (TM4SF1)在三阴性乳腺癌干细胞中的作用及靶向抑制TM4SF1通路对三阴性乳腺癌干细胞自我更新的影响。方法构建TM4SF1-RNA干扰质粒,转染三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系,经流式细胞仪进行分选,观察乳腺癌干细胞比例,进而进行细胞生长曲线、乳腺癌干细胞的克隆形成以及裸鼠成瘤能力实验等功能检测。结果特异性转染TM4SF1-RNA干扰质粒后,TM4SF1表达显著被抑制,乳腺癌干细胞比例降低,但细胞增殖速度无明显差异;形成的克隆数目明显降低。接种5周后三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系组瘤体体积明显大于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系DsiRNA-1组。结论通过靶向TM4SF1通路能够抑制三阴性乳腺癌干细胞自我更新,该通路有可能作为乳腺癌干细胞新的治疗靶点,对三阴性乳腺癌具有潜在的治疗价值。

姜黄素对高糖诱导的L6细胞线粒体功能障碍的改善作用

考察姜黄素对高糖诱导的L6细胞线粒体功能障碍的改善作用。采用40 mmol/L葡萄糖处理24 h,建立L6细胞线粒体功能障碍模型,姜黄素受试浓度分别为10、20、40μmol/L。结果显示,高糖培养可引起L6细胞线粒体功能出现明显障碍,主要表现为明显的线粒体膜电位降低、活性氧增多、ATP含量减少,线粒体生物合成(mt DNA数量)部分下降,同时UCP2、PGC-1α和Sirt3 mRNA和蛋白表达下调。姜黄素对于高糖所致线粒体功能障碍(膜电位下降,活性氧增多、ATP含量减少)具有明显的改善作用,同时升高UCP2的mRNA和蛋白表达,对于线粒体生物合成(mt DNA数量)未见明显影响。本研究提示姜黄素可能是通过多种途径的抗氧化作用而发挥线粒体保护作用。

核糖体蛋白L6在K562/A02和K562细胞株中的表达差异

目的探讨核糖体蛋白L6(ribosomal protein L6,RPL6)在急性髓细胞性白血病耐药细胞系K562/A02和敏感细胞系K562中的差异表达。方法分别从K562/A02和K562细胞中提取总RNA,以内参对照RT-PCR检测RPL6基因表达。结果RPL6在K562/A02细胞中的表达较K562高(P<0.001)。结论在耐药细胞系K562/A02高表达RPL6可能与白血病耐药有关。

基于网络药理学研究6-姜辣素改善L6成肌细胞糖脂代谢紊乱的作用机制

运用网络药理学研究6-姜辣素改善糖脂代谢紊乱的作用机制,并通过高果糖高油酸培养的L6大鼠成肌细胞模型进行验证。借助TCMSP数据库、SwissTargetPrediction数据库、GeneCards数据库,对6-姜辣素作用糖脂代谢紊乱的靶点进行预测,运用软件Cytoscape 3.7.1构建化合物靶点-疾病网络关系,采用STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析,利用R包进行GO功能富集和KEGG通路富集分析;运用KEGG Mapper对富集基因进行基因映射。结合GO富集分析、KEGG通路分析和基因映射结果,该研究选择PI3K-AKT信号通路、mTOR、NF-κB-p65、ERK分子进一步进行体外实验验证。通过高果糖高油酸构建L6大鼠成肌细胞糖脂代谢紊乱模型,对细胞进行甘油三酯(TG)测定和油红染色,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测炎症相关蛋白IL-1β、TNF-α的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测6-姜辣素对PI3K-AKT信号通路、mTOR、NF-κB-p65、ERK分子的基因、蛋白表达的影响。网络药理学分析共得到6-姜辣素治疗糖脂代谢紊乱靶点113个,GO富集分析发现与蛋白质激酶活性关系密切,KEGG富集共筛选出20条相关信号通路,包括PI3K-AKT信号通路、乙型肝炎、丙型肝炎、人类巨细胞病毒感染、自噬等。体外实验表明6-姜辣素能减少高果糖高油酸诱导的L6细胞脂质积累,减少炎症相关蛋白IL-1β、TNF-α的表达,上调AKT的基因和蛋白磷酸化水平,下调mTOR、NF-κB-p65、ERK的磷酸化水平。这些结果提示6-姜辣素能够改善高果糖高油酸诱导的L6大鼠成肌细胞糖脂代谢紊乱,其机制可能与激活PI3K-AKT-mTOR轴改善胰岛素敏感性和抑制NF-κB-p65、ERK的磷酸化降低炎症反应有关,这为后续的基础研究提供理论基础。

委陵菜提取物对L6肌细胞糖代谢影响的研究

研究了委陵菜中醇提物和氯仿碱性提物组分对L6肌肉细胞糖代谢的影响。结果表明:委陵菜的醇提物和氯仿碱性粗提物均有促进L6肌肉细胞糖代谢的作用,其中的氯仿碱性粗提物作用更为明显,随着浓度的增加作用效果增强。氯仿碱性提取物的体外代谢液对L6肌肉细胞的糖代谢有明显的促进作用,但作用效果与该提取物本身无显著差异。

委陵菜黄酮衍生物促进L6细胞GLUT4的转位活性

目的：筛选出具有促进骨骼肌细胞L6表面GLUT4转位活性的委陵菜黄酮衍生物。方法：将实验细胞分成空白对照组，胰岛素组（以胰岛素刺激20min）和黄酮衍生物组（加不同衍生物刺激24h），用类ELISA法测定细胞膜上GLUT4的量。结果：对黄酮衍生物1～14影响L6大鼠骨骼肌细胞GLUT4转运的实验结果表明，衍生物1、5、6、8～11在10μg／mL作用浓度下，促进GLUT4转位的量分别为空白对照组的（3．60±0．30）倍、（3．66±0．26）倍、（2．87±0．49）倍、（3．97±0．37）倍、（2．82±0．45）倍、（3．37±0．67）倍、（4．43±0．61）倍（P〈0．05）。化合物6与胰岛素叠加作用为空白对照组的（4．31±0．22）倍（P〈0．05）。结论：委陵菜黄酮衍生物促进GLUT4转位的作用为首次报道。黄酮衍生物1、5、6、8～11有明显地促进L6表面GLUT4转位的作用；化合物6与胰岛素有协同作用。

紫心甘薯黄酮改善L6细胞胰岛素抵抗的有效部位筛选

目的:采用L6细胞胰岛素抵抗模型,筛选出能有效改善胰岛素抵抗的不同极性紫心甘薯黄酮提取液,并初步探讨其作用机制。方法:建立L6细胞胰岛素抵抗模型,采用不同极性的紫心甘薯黄酮提取液进行干预,观察并比较加液前后的细胞胰岛素抵抗L6细胞的剩余葡萄糖量。结果:紫心甘薯总黄酮提取液、正丁醇提取液中、高剂量组,氯仿提取液低、中、高剂量组葡萄糖剩余浓度明显小于IR组(P<0.05)。结论:紫心甘薯总黄酮提取物、氯仿萃取液、正丁醇萃取液均具有缓解L6细胞胰岛素抵抗的作用。

槐属二氢黄酮G促进L6细胞内GLUT4的表达和转运

利用细胞葡萄糖摄取检测试剂盒检测苦参中槐属二氢黄酮G(Sophoraflavanone G,SFG)对L6细胞葡萄糖摄取的影响,发现SFG能够增加大鼠成肌细胞(L6)的葡萄糖摄取;之后,使用Western blot检测发现SFG对L6细胞内GLUT4的表达有显著的促进作用;同时.在可稳定表达IRAP-mOrange荧光蛋目的L6细胞内,使用激光共聚焦显微镜监测SFG作用下葡萄糖转位蛋白4(glucose transporter 4.GLUT4)的转位,发现SFG对GLUT4的转位有显著的促进作用,而且SFG对GLUT4转位的促进呈浓度依赖性;另外,免疫荧光实验结果也显示SFG增强L6细胞中GLUT4与细胞膜的融合.这些结果显示利用SFG处理L6细胞后丄6细胞内GLUT4的表达、转运及与细胞膜的融合继而促进葡萄糖的摄取显著增强,说明SFG可能具备开发成一种新的降血糖药物的潜力.

海南蒲桃提取物对L6细胞砷中毒缓解作用的体外实验(英文)

目的:研究海南蒲桃提取物对砷酸盐引起的L6骨骼肌细胞葡萄糖内稳态破坏及线粒体功能异常的缓解作用。方法:通过测量多个指标如丙酮酸激酶活性、葡糖激酶、线粒体膜电位等衡量细胞内葡萄糖水平及线粒体功能,并测量相关标志物的蛋白质及mRNA表达情况,如葡萄糖转运体4、胰岛素受体基质1、胰岛素受体基质2、葡糖激酶等以分析可能有关的信号通路。结果:海南蒲桃提取物能够通过葡萄糖转运体4通路改善砷中毒的L6细胞内诸多标志物的表达,使其正常化,与模型组相比差异有统计学意义。结论:海南蒲桃提取物对细胞砷中毒有明显的缓解作用,未来可考虑将其用于治疗砷中毒相关疾病如高血糖症等。

高内涵成像仪检测生脉饮中的药味对葡萄糖转运蛋白4易位的影响

目的本研究将通过高内涵成像仪检测红参、麦冬、五味子的总提取物是否影响葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的易位和葡萄糖摄取,并且验证高内涵成像仪是否可以用于检测GLUT4易位。方法L6-GLUT4myc细胞经过给药和胰岛素刺激30 min后,检测GLUT4易位和葡萄糖摄取。结果红参、麦冬、五味子的提取物显著增加了GLUT4-myc的表达,并且同时也增加了葡萄糖的摄取。结论红参、麦冬、五味子的总提取物是通过增加了GLUT4的易位而增加了葡萄糖的代谢。此外本研究也证明L6-GLUT4myc细胞株可以结合高内涵成像系统进行针对刺激GLUT4易位的筛选研究。