羊布鲁氏菌BCSP31、OMP31、L7/L12基因的原核表达载体构建及表达

目的构建羊布鲁氏菌外膜蛋白BCSP31、OMP31和L7/L12基因的重组表达质粒,并在原核系统中表达。方法根据羊布鲁氏菌M5株外膜蛋白BCSP31、OMP31和抗原L7/L12蛋白基因序列设计引物,分别扩增出大小约为1kb、730bp和380bp的目的基因片断,插入pGEM7Zf(+)中测序并进行分析。将3种基因片段亚克隆入pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western-blot进行分析鉴定。结果SDS-PAGE结果表明3个目的蛋白均以融合蛋白的方式成功表达,在相对分子量57kDa、49kDa、38kDa处有表达条带,经薄层扫描分析,目的蛋白分别占全菌蛋白的42%、36%、40%。Western-blot证实3种融合蛋白均能被布鲁氏菌免疫兔血清识别。结论成功构建了3种蛋白的表达载体并进行了高效表达,3种蛋白均具有良好的免疫原性。

布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的表达纯化及生物活性鉴定

目的:原核表达系统表达布鲁菌核糖体蛋白L7/L12与GST的融合蛋白GST-L7/L12,并纯化蛋白L7/L12,建立检测特异性抗体的间接ELISA方法。方法:对含有L7/L12的原核表达载体pGEX-4T-1-L7/L12进行了原核表达。利用亲和层析柱分别纯化融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12,并用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定。以L7/L12为抗原包被微量板,优化抗原包被浓度和羊抗鼠IgG-HRP稀释度,建立间接ELISA方法,并检测其特异性。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量为38000和12000处可见纯化蛋白的条带,Western印迹分析表明这2条带均能被免疫兔血清识别,表明获得了纯化的有生物活性的融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12。间接ELISA方法的L7/L12抗原包被浓度为5μg/mL,羊抗鼠酶标二抗稀释度为1∶1000。小鼠免疫血清与L7/L12抗原出现阳性反应,而与布鲁菌融合蛋白OMP31、结核分枝杆菌抗原85b及牛血清白蛋白则呈阴性。结论:成功地对布鲁菌核糖体蛋白L7/L12进行了原核表达和纯化,以其为基础建立的间接ELISA方法稳定且特异。

布鲁氏菌L7/L12、OMP31基因的克隆、测序及免疫原性分析

为研制鹿布鲁氏菌病工程疫苗,根据已发表的布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12、外膜蛋白OMP31基因设计两对引物进行扩增,PCR产物连接pGEM-Teasy载体,转化DH5α后测序,并进行基因分析。结果从布鲁氏菌疫苗株中克隆出L7/L12和OMP312个目的基因,同源分析L7/L12达97.1%,OMP31达100%,免疫原性分析可作为免疫优势抗原。

抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12单克隆抗体制备及初步鉴定

制备抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体(mAb),为进一步研制布鲁菌检测方法和免疫制剂提供基础。常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗核糖体蛋白L7/L12的mAb,并用Westernblot和ELISA方法对其特异性、抗原识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定。获得了4株抗L7/L12蛋白的mAb:1B1,2A2,2H9和2H10,相对亲和力为2A2>2H10>2H9>1B1,4株mAb识别的抗原表位相近,但仍存在一定的差异。得到的4株稳定的杂交瘤细胞系分泌的mAb能特异结合L7/L12蛋白。

布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备布鲁菌(Brucella)L7/L12蛋白及其小鼠源多克隆抗体,根据猪布鲁菌(Brucella suis)S2株L7/L12基因序列,设计合成特异性引物,PCR扩增L7/L12基因并将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a-L7/L12,经鉴定正确后转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为17ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western blot结果表明,原核表达后纯化的L7/L12蛋白能够与制得的小鼠抗L7/L12蛋白多克隆抗体特异性结合。成功获得了纯化的L7/L12重组蛋白和小鼠抗L7/L12多克隆抗体,为进一步研究L7/L12蛋白对布鲁菌感染的诊断方法和基因工程疫苗的研发奠定了基础。

新疆羊种布鲁氏菌分离株的鉴定与L7/L12蛋白的原核表达和生物信息学分析

【目的】分离并鉴定新疆羊种布鲁氏菌。原核表达该菌的L7/L12蛋白,检测该蛋白的反应原性及进行部分生物学分析。【方法】采用细菌划线培养、形态学观察、PCR检测以及生化试验进行布鲁氏菌分离鉴定。利用常规分子生物学方法表达并纯化羊种布鲁氏菌分离株的L7/L12蛋白,应用Western Blot分析融合蛋白的反应原性。使用生物信息学软件对该蛋白进行了生物信息学分析。【结果】分离鉴定确定该菌株为羊种布鲁氏菌。经过测序与酶切鉴定,正确构建了表达载体p ET-28a-L7/L12.SDS-PAGE试验显示纯化的L7/L12蛋白为单一条带;经过Western Blot检测,该融合蛋白具有良好的反应原性。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构α-螺旋为主并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。【结论】鉴定出该分离菌株,表达并纯化了该菌的L7/L12融合蛋白,Western Blot证明该蛋白具有良好的反应原性,为后续该蛋白的亚单位疫苗研究奠定了基础。

布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建及免疫效果分析

利用Overlap PCR方法连接基因L7/L12和GroES,分别利用pET32a和pcDNA3.1构建原核和真核表达质粒,分别命名为pET32a-LG和pcDNA3.1-LG。原核表达并纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,用于验证真核表达载体目的基因的表达;重组真核表达质粒pcDNA3.1-LG转染293T细胞,经间接免疫荧光和Western blot验证蛋白成功表达。真核质粒免疫小鼠后,利用ELISA方法检测血清抗体水平,淋巴细胞转化试验检测细胞免疫水平,结果显示,该重组质粒具有良好的免疫效果。

布鲁菌二联BCSP31-L7/L12-IL-2嵌合病毒样颗粒疫苗候选株的构建与鉴定

布鲁菌病的传统疫苗存在接种后干扰血清学诊断及可能出现毒力返强等缺点,严重干扰疫病监测,影响疫病净化。因此,本研究基于新城疫病毒样颗粒(ND virus like particles,ND VLPs)载体平台,利用昆虫杆状病毒表达系统和GPI锚定策略,以免疫增强因子IL-2、高保守性的保护性抗原蛋白L7/L12(来源猪种S2株)和羊种BCSP31蛋白(来源羊种M5株)为靶点,构建绿色、安全的布鲁菌二联嵌合型病毒样颗粒新型疫苗候选株(BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs)。PCR及免疫荧光结果表明成功构建了表达IL-2和L7/L12蛋白的重组杆状病毒,Western blot结果显示该cVLPs各组分蛋白正确表达,透射电镜观察可见表面展示纤突结构、大小约为100 nm的粒子,表明布鲁菌二联嵌合型病毒样颗粒BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs构建成功。

布氏杆菌pCDNA3.1-L7L12核酸疫苗的构建及其免疫学评价

目的 获得布氏杆菌保护性抗原L7 L12重组蛋白及pCDNA3.1 L7 L12重组质粒 ,并比较其诱导特异性免疫应答的能力。方法 PCR扩增布氏杆菌核蛋白L7 L12基因分别构建至原核表达载体PET32a(+)和真核表达载体pCDNA3.1(+)中 ;pET32a L7 L12重组质粒转化BL2 1(DE3) ,所表达蛋白经SDS PAGE、免疫印迹分析、纯化后免疫小鼠 ;pCDNA3.1 L7 L12重组质粒配以GM CSF同时肌肉注射免疫小鼠 ,3次免疫后测定免疫功能进行免疫效果的评价。结果 ELISA、Westernblot检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生 ,蛋白苗所诱导的抗体效价远远高于DNA疫苗 ;通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发TH1 型免疫为主。结论 所构建的布氏杆菌DNA疫苗和蛋白苗均具有诱导特异性细胞和体液免疫应答的能力 ,DNA疫苗诱导产生的细胞免疫反应强于蛋白苗 ,可作为潜在的布氏菌新型疫苗 。

布鲁氏菌S2株L7/L12蛋白B细胞线性抗原表位的预测与鉴定

目的预测猪布鲁氏菌S2株L7/L12蛋白B细胞线性抗原表位,并鉴定其抗原性。方法以布鲁氏菌S2株为对象,采用NCBI提供的BLAST程序分析其L7/L12蛋白与原核模式生物大肠埃希菌L7/L12蛋白的同源性;使用IEDB网络服务器初步预测B细胞线性表位;在大肠埃希菌L7/L12蛋白空间结构的基础上,使用SWISS-MODEL服务器构建猪布鲁氏菌S2株L7/L12蛋白空间结构模型,参考空间结构特点筛选符合形成表位的区域,同时分析区域内易形成表位的3种氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、半胱氨酸)所在位置,综合分析以上结果获得所预测表位;以预测表位序列为基础,人工合成表位多肽-匙孔血蓝蛋白复合抗原并包被酶标板,分别以rL7/L12多克隆抗体及小鼠布鲁氏菌免疫血清为一抗,采用间接ELISA方法验证所预测表位的抗原活性。结果 L7/L12含有潜在的B细胞线性抗原表位,所预测表位区位于N末端第51-66aa,60-75aa,87-102aa;ELISA检测合成的表位多肽蛋白复合物抗原性,60-75aa表位能够与rL7/L12多克隆抗体及布鲁氏菌免疫鼠血清抗体结合。结论筛选的猪布鲁氏菌L7/L12蛋白B细胞线性表位位于N末端第60-75aa区域,具有与特异性血清结合的能力,为布鲁氏菌的感染诊断与疫苗研发奠定了基础。

布鲁氏菌S2株L7/L12蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的用大肠埃希菌表达布鲁氏菌S2株L7/L12蛋白,制备其多克隆抗体。方法设计引物,以S2弱毒株DNA基因组为模板扩增目的基因片段L7/L12,构建pET28a-L7/L12质粒并转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE检测表达蛋白的可溶性及其分子质量;金属亲和层析法纯化目的蛋白,BCA法对纯化蛋白定量。将rL7/L12蛋白与弗氏完全佐剂混合(终浓度为0.5mg/ml),每次1ml分两次间隔21d免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。免疫结束后12d,颈静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测血清抗体效价。以免疫血清1∶200倍稀释作为一抗,采用Western blot分析其与r-L7/L12、布鲁氏菌S2株全菌体蛋白及大肠埃希菌DH5α全菌体蛋白结合的特异性。结果经测序与酶切鉴定,成功构建表达载体pET28a-L7/L12,SDS-PAGA分析表达产物部分为可溶性,分子质量单位约为14ku;SDS-PAGE分析亲和纯化蛋白为单一条带,蛋白质含量为0.8mg/ml。间接ELISA检测免疫血清抗体效价为1∶12 800,该抗体能够与r-L7/L12、布鲁氏菌S2株全菌体蛋白结合,而不与大肠埃希菌DH5α菌体蛋白结合。结论成功克隆L7/L12基因并表达出目的蛋白,制备的抗布鲁氏菌S2株r-L7/L12多克隆抗体能特异识别该表达蛋白。

载体介导的布鲁氏菌L7/L12疫苗研制现状

布鲁氏菌感染引起的布鲁氏菌病是一种严重危害人类健康的人畜共患传染病,采用疫苗防治该菌是当前研究的热点领域之一。L7/L12蛋白是一种有效的疫苗候选分子,本文综述鼠伤寒沙门氏菌、乳酸乳球菌、大肠埃希菌、酿酒酵母和禽流感病毒等载体介导的布鲁氏菌L7/L12疫苗的研制现状。

布鲁氏菌L7/L12蛋白的基因克隆与原核表达

本研究对羊布鲁氏菌L7/L12蛋白进行了表达和纯化。首先从布鲁氏菌M5基因组中克隆L7/L12目的基因片段,连接至pMD-19T载体,转化入E.coli DH5α感受态细胞,PCR鉴定及测序鉴定正确后对其进行双酶切,构建重组质粒pGEX-6P-1-L7/L12并利用E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。羊布鲁氏菌L7/L12基因片段大小为375 bp。SDS-PAGE检测蛋白大小为13 kD,与预测值相符。Western blotting方法检测其免疫学特性。实验结果表明,成功构建了pGEX-6P-1-L7/L12原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了L7/L12重组蛋白,Western blotting法检测其具有免疫反应。本实验为下一步研究蛋白功能及布鲁氏菌新型疫苗的研制提供了实验基础。

牛布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化牛布鲁菌L7/L12蛋白。方法提取牛布鲁菌S19基因组DNA,PCR法扩增L7/L12基因,经测序正确后,克隆至pET-28a(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-L7/L12,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量,经亲和层析纯化后,Western blot鉴定纯化产物。结果所构建的重组原核表达质粒pET-L7/L12经酶切鉴定表明构建正确。重组蛋白以包涵体形式表达,表达量占全菌总蛋白的33%;纯化的重组蛋白纯度可达94%,可与布鲁菌小鼠免疫血清发生特异反应。结论已成功表达并纯化了牛布鲁菌L7/L12蛋白,为建立高特异性的新型布鲁菌检测方法奠定了基础。

以核糖体蛋白L7/L12为分子标志物精准检测肺炎链球菌的研究

目的:以核糖体蛋白L7/L12为标志物,探索一种胶体金免疫层析法快速检测肺炎链球菌的方法。方法:分析核糖体蛋白L7/L12基因序列,构建原核表达载体,表达纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体;利用无标记分子相互作用仪检测抗原抗体亲和力;以双抗夹心法研制胶体金免疫层析检测试纸条,并对其特异性、敏感性及稳定性进行验证分析。结果:筛选得到两株高效分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,两种单克隆抗体均与抗原有高的亲和力并且无竞争,制作的试纸最低检出限为1.0×10^5CFU/ml;其与肺炎链球菌有特异性反应,而与其它9种常见呼吸道病原菌均无交叉反应;试纸条在25℃下保存12个月仍具有良好的重复性和稳定性。结论:RP-L7/L12可作为肺炎链球菌的检测标志物,以其单抗制备的胶体金免疫层析试纸可适用于肺炎链球菌的快速检测。

布鲁菌真核表达载体pVAX1-L7/L12-Omp31的构建及鉴定

根据Gen Bank中的布鲁菌核糖体蛋白L7/L12和外膜蛋白Omp31的基因序列设计引物,用重叠延伸PCR方法扩增融合基因,将基因克隆至p VAX1载体,构建p VAX1-L7/L12-Omp31重组质粒。采用脂质体转染的方法,将融合质粒转入Vero细胞中,用间接免疫荧光法和Western blotting检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果显示:转染48 h后,融合基因蛋白在细胞内高效表达,为研究融合质粒在布鲁氏菌病动物模型中的免疫效果奠定了基础。

大肠杆菌N~α-乙酰转移酶RimL^E的表达、纯化及活性测定

目的:在体外鉴定大肠杆菌Nα-乙酰转移酶RimL(RimLE)的功能。RimL可以通过将原核生物的核糖体蛋白L12的N端氨基乙酰化,使其转化成L7。方法:通过PCR从大肠杆菌基因组中钓取RimLE和L12/L7E的基因,将其插入pET系统,转化大肠杆菌BL21(DE3),培养后提取、纯化得到RimLE和L12E。结果:RimLE在体外可将L12E的N端氨基乙酰化,最大反应速率为25.63/min。结论:为研究原核生物中Nα-乙酰化的分子机制及其功能奠定了基础。

以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析

目的构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础。方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd+-pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd+-pVAX1-BLS-L7/L12)。以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价。结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生。通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主。可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗。

载体介导的布鲁氏菌疫苗的研制现状

布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病是一种严重危害人畜健康的传染性疾病,采用疫苗防治该菌是当前研究的热点领域之一。OMP、SOD和L7/L12抗原是3种有效的疫苗候选分子,本文综述了鼠伤寒沙门氏菌、乳酸乳球菌、卡介苗、人赭菌、根癌农杆菌、大肠埃希菌、小肠结肠耶尔森菌、毕赤酵母、禽流感病毒、Semliki森林病毒、山羊痘病毒、牛痘病毒、腺病毒血清型5、伪狂犬病毒和昆虫杆状病毒等载体介导的布鲁氏菌疫苗的研制现状。

酸性核糖体磷酸化蛋白P0的研究进展

原核生物和真核生物的核糖体大亚基上都存在着一类与蛋白质翻译密切相关的酸性核糖体磷酸化蛋白。在真核生物它们是酸性核糖体磷酸化蛋白P0，P1，P2（acidic ribosomal phosphoproteins PO。P1andP2），而在原核生物如Escheriehiacoli体内，它们分别为LIO和L7／L12蛋白．其中与P0蛋白相对应的蛋白为LIO，与P1、P2蛋白相对应的蛋白为L7／L12。原核生物和真核生物的酸性核糖体磷酸化蛋白在结构和功能上具有高度的同源性，所不同的是在原核生物，L7／L12蛋白是由同一基因编码的，