布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备布鲁菌(Brucella)L7/L12蛋白及其小鼠源多克隆抗体,根据猪布鲁菌(Brucella suis)S2株L7/L12基因序列,设计合成特异性引物,PCR扩增L7/L12基因并将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a-L7/L12,经鉴定正确后转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为17ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western blot结果表明,原核表达后纯化的L7/L12蛋白能够与制得的小鼠抗L7/L12蛋白多克隆抗体特异性结合。成功获得了纯化的L7/L12重组蛋白和小鼠抗L7/L12多克隆抗体,为进一步研究L7/L12蛋白对布鲁菌感染的诊断方法和基因工程疫苗的研发奠定了基础。

牛布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化牛布鲁菌L7/L12蛋白。方法提取牛布鲁菌S19基因组DNA,PCR法扩增L7/L12基因,经测序正确后,克隆至pET-28a(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-L7/L12,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量,经亲和层析纯化后,Western blot鉴定纯化产物。结果所构建的重组原核表达质粒pET-L7/L12经酶切鉴定表明构建正确。重组蛋白以包涵体形式表达,表达量占全菌总蛋白的33%;纯化的重组蛋白纯度可达94%,可与布鲁菌小鼠免疫血清发生特异反应。结论已成功表达并纯化了牛布鲁菌L7/L12蛋白,为建立高特异性的新型布鲁菌检测方法奠定了基础。

布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的表达纯化及生物活性鉴定

目的:原核表达系统表达布鲁菌核糖体蛋白L7/L12与GST的融合蛋白GST-L7/L12,并纯化蛋白L7/L12,建立检测特异性抗体的间接ELISA方法。方法:对含有L7/L12的原核表达载体pGEX-4T-1-L7/L12进行了原核表达。利用亲和层析柱分别纯化融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12,并用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定。以L7/L12为抗原包被微量板,优化抗原包被浓度和羊抗鼠IgG-HRP稀释度,建立间接ELISA方法,并检测其特异性。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量为38000和12000处可见纯化蛋白的条带,Western印迹分析表明这2条带均能被免疫兔血清识别,表明获得了纯化的有生物活性的融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12。间接ELISA方法的L7/L12抗原包被浓度为5μg/mL,羊抗鼠酶标二抗稀释度为1∶1000。小鼠免疫血清与L7/L12抗原出现阳性反应,而与布鲁菌融合蛋白OMP31、结核分枝杆菌抗原85b及牛血清白蛋白则呈阴性。结论:成功地对布鲁菌核糖体蛋白L7/L12进行了原核表达和纯化,以其为基础建立的间接ELISA方法稳定且特异。

布氏杆菌pCDNA3.1-L7L12核酸疫苗的构建及其免疫学评价

目的 获得布氏杆菌保护性抗原L7 L12重组蛋白及pCDNA3.1 L7 L12重组质粒 ,并比较其诱导特异性免疫应答的能力。方法 PCR扩增布氏杆菌核蛋白L7 L12基因分别构建至原核表达载体PET32a(+)和真核表达载体pCDNA3.1(+)中 ;pET32a L7 L12重组质粒转化BL2 1(DE3) ,所表达蛋白经SDS PAGE、免疫印迹分析、纯化后免疫小鼠 ;pCDNA3.1 L7 L12重组质粒配以GM CSF同时肌肉注射免疫小鼠 ,3次免疫后测定免疫功能进行免疫效果的评价。结果 ELISA、Westernblot检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生 ,蛋白苗所诱导的抗体效价远远高于DNA疫苗 ;通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发TH1 型免疫为主。结论 所构建的布氏杆菌DNA疫苗和蛋白苗均具有诱导特异性细胞和体液免疫应答的能力 ,DNA疫苗诱导产生的细胞免疫反应强于蛋白苗 ,可作为潜在的布氏菌新型疫苗 。

抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12单克隆抗体制备及初步鉴定

制备抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体(mAb),为进一步研制布鲁菌检测方法和免疫制剂提供基础。常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗核糖体蛋白L7/L12的mAb,并用Westernblot和ELISA方法对其特异性、抗原识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定。获得了4株抗L7/L12蛋白的mAb:1B1,2A2,2H9和2H10,相对亲和力为2A2>2H10>2H9>1B1,4株mAb识别的抗原表位相近,但仍存在一定的差异。得到的4株稳定的杂交瘤细胞系分泌的mAb能特异结合L7/L12蛋白。

羊布鲁氏菌BCSP31、OMP31、L7/L12基因的原核表达载体构建及表达

目的构建羊布鲁氏菌外膜蛋白BCSP31、OMP31和L7/L12基因的重组表达质粒,并在原核系统中表达。方法根据羊布鲁氏菌M5株外膜蛋白BCSP31、OMP31和抗原L7/L12蛋白基因序列设计引物,分别扩增出大小约为1kb、730bp和380bp的目的基因片断,插入pGEM7Zf(+)中测序并进行分析。将3种基因片段亚克隆入pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western-blot进行分析鉴定。结果SDS-PAGE结果表明3个目的蛋白均以融合蛋白的方式成功表达,在相对分子量57kDa、49kDa、38kDa处有表达条带,经薄层扫描分析,目的蛋白分别占全菌蛋白的42%、36%、40%。Western-blot证实3种融合蛋白均能被布鲁氏菌免疫兔血清识别。结论成功构建了3种蛋白的表达载体并进行了高效表达,3种蛋白均具有良好的免疫原性。

布鲁氏菌L7/L12、OMP31基因的克隆、测序及免疫原性分析

为研制鹿布鲁氏菌病工程疫苗,根据已发表的布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12、外膜蛋白OMP31基因设计两对引物进行扩增,PCR产物连接pGEM-Teasy载体,转化DH5α后测序,并进行基因分析。结果从布鲁氏菌疫苗株中克隆出L7/L12和OMP312个目的基因,同源分析L7/L12达97.1%,OMP31达100%,免疫原性分析可作为免疫优势抗原。

布鲁菌二联BCSP31-L7/L12-IL-2嵌合病毒样颗粒疫苗候选株的构建与鉴定

布鲁菌病的传统疫苗存在接种后干扰血清学诊断及可能出现毒力返强等缺点,严重干扰疫病监测,影响疫病净化。因此,本研究基于新城疫病毒样颗粒(ND virus like particles,ND VLPs)载体平台,利用昆虫杆状病毒表达系统和GPI锚定策略,以免疫增强因子IL-2、高保守性的保护性抗原蛋白L7/L12(来源猪种S2株)和羊种BCSP31蛋白(来源羊种M5株)为靶点,构建绿色、安全的布鲁菌二联嵌合型病毒样颗粒新型疫苗候选株(BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs)。PCR及免疫荧光结果表明成功构建了表达IL-2和L7/L12蛋白的重组杆状病毒,Western blot结果显示该cVLPs各组分蛋白正确表达,透射电镜观察可见表面展示纤突结构、大小约为100 nm的粒子,表明布鲁菌二联嵌合型病毒样颗粒BCSP31-L7/L12-IL-2 cVLPs构建成功。

载体介导的布鲁氏菌L7/L12疫苗研制现状

布鲁氏菌感染引起的布鲁氏菌病是一种严重危害人类健康的人畜共患传染病,采用疫苗防治该菌是当前研究的热点领域之一。L7/L12蛋白是一种有效的疫苗候选分子,本文综述鼠伤寒沙门氏菌、乳酸乳球菌、大肠埃希菌、酿酒酵母和禽流感病毒等载体介导的布鲁氏菌L7/L12疫苗的研制现状。

以核糖体蛋白L7/L12为分子标志物精准检测肺炎链球菌的研究

目的:以核糖体蛋白L7/L12为标志物,探索一种胶体金免疫层析法快速检测肺炎链球菌的方法。方法:分析核糖体蛋白L7/L12基因序列,构建原核表达载体,表达纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体;利用无标记分子相互作用仪检测抗原抗体亲和力;以双抗夹心法研制胶体金免疫层析检测试纸条,并对其特异性、敏感性及稳定性进行验证分析。结果:筛选得到两株高效分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,两种单克隆抗体均与抗原有高的亲和力并且无竞争,制作的试纸最低检出限为1.0×10^5CFU/ml;其与肺炎链球菌有特异性反应,而与其它9种常见呼吸道病原菌均无交叉反应;试纸条在25℃下保存12个月仍具有良好的重复性和稳定性。结论:RP-L7/L12可作为肺炎链球菌的检测标志物,以其单抗制备的胶体金免疫层析试纸可适用于肺炎链球菌的快速检测。

酸性核糖体磷酸化蛋白P0的研究进展

原核生物和真核生物的核糖体大亚基上都存在着一类与蛋白质翻译密切相关的酸性核糖体磷酸化蛋白。在真核生物它们是酸性核糖体磷酸化蛋白P0，P1，P2（acidic ribosomal phosphoproteins PO。P1andP2），而在原核生物如Escheriehiacoli体内，它们分别为LIO和L7／L12蛋白．其中与P0蛋白相对应的蛋白为LIO，与P1、P2蛋白相对应的蛋白为L7／L12。原核生物和真核生物的酸性核糖体磷酸化蛋白在结构和功能上具有高度的同源性，所不同的是在原核生物，L7／L12蛋白是由同一基因编码的，