烟草单染色体的分离与扩增及其SSR的检测

以普通烟草根尖为材料,在显微操作仪下分离单染色体,并用LAM-PCR方法进行扩增.对扩增产物用点杂交进行鉴定,用Southern杂交确定目的扩增片段的大小,并用本实验室开发的SSR特异引物检测SSR位点.结果表明:获得的单染色体扩增产物均存在来自烟草基因组的序列,扩增产物大小为250-3000 bp;利用SSR特异引物可以从单染色体扩增产物中检测到目标SSR位点.

毛叶枣APETALA1同源基因的克隆

分析在植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1(AP1)基因的保守区序列 ,设计 1对长度为 2 3bp的PCR引物 ,以毛叶枣基因组DNA为模板 ,采用PCR方法扩增出长为 648bp的DNA片段 ,克隆入pUCm T载体 ,测序和序列分析结果表明获得了毛叶枣AP1同源基因中部的 1个片段 ,该片段有 2个内含子 ,长度分别为15 2bp和 386bp ,编码区共编码 36个氨基酸 ,其序列已在GenBank中登记 (登记号为AF35 65 41) .在GenBank中进行同源性检索 ,结果表明其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达 66 %～ 88% 。

小叶锦鸡儿根瘤菌的分离及其16S rDNA PCR-RFLP分析

对辽宁地区与小叶锦鸡儿共生的根瘤菌资源进行了初步调查。采自5个不同地区样品的根瘤,通过分离、纯化、回接验证等试验共获得65株供试根瘤菌菌株。进一步选用4种限制性内切酶对供试根瘤菌进行了16S rDNA PCR-RFLP研究,结果表明其系统发育地位位于中慢生根瘤菌属(Mesorhizobiumspp.),并在96%相似性水平上分为5个不同的类群,分别由相应的rDNA图谱组合代表。丰富度及频度分析表明,组合15是辽宁省的优势群,组合18丰富度居第二位,但频度最高,也是辽宁省的主要类群。

山杏SSR-PCR反应体系优化

以4种山杏群体为试材,采用L16(45)正交实验设计,研究了适合4种山杏群体的SSR-PCR反应体系。结果表明:总反应体系为20μL,其中DNA模板量20ng,引物浓度0.15μmol·L^(-1),Mg2+2.0mmol·L^(-1),Taq聚合酶量1.0U,dNTPs 0.25mmol·L^(-1)。采用引物Y45对43个山杏无性系的DNA进行扩增,扩增产物在100~200bp,多态性良好,稳定度高,可以用于山杏SSR分子标记研究。

菠萝蜜实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选菠萝蜜实时荧光定量PCR研究用的内参基因,以菠萝蜜不同发育阶段的果实、叶和花序为材料,分析GAPDH、18S rRNA、UBQ、ɑ-tubulin和β-tubulin 5个内参基因的表达情况,并对其表达稳定性进行分析。结果表明,在各组织不同发育阶段中,5个内参基因的表达丰度变化存在差异;geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种方法得出的结论有所不同,经RefFinder综合评价后,果实中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA;叶片中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、β-tubulin;花序中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin。

赤芍与菟丝子对豚鼠黑素细胞酪氨酸酶活性及mRNA表达的影响

目的探讨赤芍与菟丝子对豚鼠皮肤黑素细胞酪氨酸酶活性及mRNA基因表达水平的影响,为应用中药治疗白癜风等色素减退性皮肤病提供实验依据。方法利用棕黄色豚鼠背部皮肤色素实验动物模型,多巴氧化法测定酪氨酸酶活性,然后采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测药物干预前后豚鼠皮肤中酪氨酸酶及相关蛋白-1 mRNA表达水平的变化。结果赤芍与菟丝子均呈剂量依赖性地促进酪氨酸酶活性的增加;与正常对照组相比,1g/(kg·m L)的赤芍、菟丝子组酪氨酸酶及相关蛋白-1mRNA表达水平上升,且差异有统计学意义(P<0.01);与阳性对照组8-MOP相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论赤芍、菟丝子的乙醇提取液均可上调豚鼠皮肤黑素细胞酪氨酸酶活性及促进mRNA表达,促进皮肤黑素生成。

利用远缘杂交创造核果类果树新种质的研究 Ⅱ.李、杏远缘杂种胚抢救及杂种鉴定

对李、杏远缘杂交杂种胚败育的时期进行了调查,建立了李、杏远缘杂种胚抢救技术体系,并对部分杂种进行了鉴定。结果表明,李、杏杂种胚的败育时期从第3周开始;不同胚龄李、杏杂种胚的萌发及生长不同。PF值>0.5的杂种胚可以萌发及生长,PF值<0.5的幼胚不能正常萌发。在远缘杂种胚抢救技术体系中,杂种胚最佳萌发及分化培养基为MS+6-BA 2 mg·L-1+IAA0.3 mg·L-1,胚萌发及分化率达80％,多丛芽诱导及增殖培养基为MS+6-BA1.5 mg·L-1+IAA 0.3 mg.L-1,生根培养基为1/2MS+IAA 0.8 mg·L-1。成功地将一批杂种胚培苗移栽到大田;经叶片形态及sallele-specific PCR与RAPD技术对杂种鉴定结果表明,所获杂种为真杂种。

辽宁营口地区锦鸡儿与树锦鸡儿根瘤菌遗传多样性研究

对锦鸡儿与树锦鸡儿根瘤菌进行研究,以了解其系统发育地位及遗传多样性。通过分离、纯化、回接结瘤测定共获得了31株待测菌,并采用16S rDNA PCR RFLP及BOX-PCR等方法对这些菌进行了研究。结果表明,31株待测菌的系统发育地位全部源于中间根瘤菌属(Mesorhizobium spp.),并产生5种不同的rDNA图谱组合。BOX-PCR研究中,待测菌株呈现出较高的多样性,在80%相似性水平上,将待测菌归于17个不同的类型当中。

脑脊液单核细胞ESAT-6、LAM检测和16s RNA基因检测对结核性脑膜炎的诊断价值研究

目的:探讨针对检测脑脊液单核细胞中结核杆菌分泌性的ESAT-6、LAM(lipoarabinomannan)蛋白以及16sRNA基因水平对结核性脑膜炎的诊断价值。方法:在XX医院收集病例45人,实验共分成三个组,分别是结核性脑膜炎病人20人作为结核性脑膜炎组,病毒性脑膜炎5人作为化脓性脑膜炎组,正常没有疾病的人20人作为正常组。分别分离出脑脊液单核细胞,用免疫荧光的方法检测单核细胞内ESAT-6和LAM的蛋白表达水平;另外用实时定量PCR的方法检测结核杆菌16s RNA基因。结果:单核细胞中ESAT-6蛋白在结核性脑膜炎组中有16例阳性,在5例病毒性脑膜炎病人中全阴性;LAM蛋白在结核性脑膜炎组中有14人反应阳性,在病毒性脑膜炎组中有一人阳性,约登指数0.5;定量PCR检测显示,结核性脑膜炎组中16s RNA阳性18人,正常组和病毒性脑膜炎组中都没有检测到,其敏感性为90%,特异性100%,约登指数0.90。结论:测定脑脊液单核细胞中结核杆菌分泌性的ESAT-6、LAM蛋白及16s RNA基因水平对结核性脑膜炎具有重要诊断价值。

甘薯查尔酮异构酶基因IbCHI的克隆和表达特性

根据甘薯〔Ipomoea batatas(Linn.)Lam.〕转录组数据,从甘薯品种‘福菜薯7-6’(‘Fucaishu 7-6’)中克隆获得1个编码查尔酮异构酶的基因,命名为IbCHI;IbCHI基因全长732 bp,GC含量为55.19%,共编码243个氨基酸。生物信息学分析结果表明:在IbCHI基因编码的氨基酸序列第12至第214位包含1个Chalcone结构域;IbCHI蛋白分子式为C1156H1831N291O351S7,理论相对分子质量为25646.41,理论等电点为pI 5.25,并可能具有1个跨膜螺旋区,定位于细胞核和细胞膜上;其氨基酸序列中包含24个带正电荷和27个带负电荷的氨基酸残基,丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸和甘氨酸所占比例较高,半胱氨酸所占比例最低;IbCHI蛋白的不稳定指数和总亲水性平均系数分别为38.49和0.074,表明IbCHI蛋白是一种稳定的亲水性蛋白质;IbCHI蛋白二级结构中,α螺旋、随机卷曲、延伸链和β转角所占比例分别为39.51%、31.69%、20.16%和8.64%。多重比对结果显示:IbCHI基因与同属种类圆叶牵牛(I.purpurea Lam.)和牵牛〔I.nil(Linn.)Roth〕CHI基因编码的氨基酸序列高度相似(相似度90%以上),且在系统发育树上聚为同一支。IbCHI基因启动子区包含启动子基本元件TATA-box和CAAT-box,以及胁迫响应元件、茉莉酸甲酯响应元件和光响应元件等26个顺式作用元件。qRT-PCR分析结果表明:IbCHI基因在供试4个甘薯品种‘EC15’、‘EC16’、‘福菜薯18’(‘Fucaishu 18’)和‘福菜薯7-6’的根、茎、茎尖和叶中均有表达,但其在不同品种和器官间的相对表达量存在明显差异,其中,‘福菜薯7-6’茎和叶中IbCHI基因的相对表达量显著高于其他3个品种。经干旱(质量体积分数30%PEG6000)和盐(0.2 mol·L^-1 NaCl)处理后,IbCHI基因的相对表达量随处理时间的延长均呈先下降后上升的趋势,并在处理24 h后该基因的相对表达量显著(P<0.05)升高。综合分析结果表明:甘薯IbCHI蛋白属于Chalcone超级家族,具有较高的保守性;IbCHI基因的表达具有组织和品种特异性,且在调控甘薯对非生物胁迫的响应过程中起重要作用。

Creating New Germplasm by Distant Hybridization in Stone Fruits:Ⅱ-Embryo Rescue and Hybrid Identification Between Plum and Apricot

Embryo abortion stage and rescue system of hybrids were studied in the distant hybridizationbetween plum and apricot. Identification of the hybrids was also made. The resultsshowed: (1) Embryo abortion started from three weeks after pollination. (2) The germinationand growth of embryos were different at different growth stages, which could germinateand grow with PF value>0.5, but failed with PF value<0.5. In embryo rescue system ofhybrids, the best germination and differentiation medium was MS+6-BA 2mgL-1+IAA 0.3mgL-1,the rate of germination and differentiation reached up to 80%, bud induction andmultiplication medium was MS+6-BA 1.5mgL-1+IAA 0.3mgL-1, rooting medium was 1/2 MS+IAA0.8mgL-1. Some hybrids were transplanted into the field successfully. (3) Leaf shapeinvestigation and identification by S allele-specific PCR and RAPDs showed that thehybrids were true ones.

三种方法联合检测对菌阴肺结核的诊断价值

目的 :探讨血清抗结核抗体 (LAM )、痰聚合酶链反应 (PCR)、结核菌素的纯蛋白衍生物 (PPD) 5IU皮内注射试验三种方法联合检测对菌阴肺结核的诊断价值。方法 :以PCR ,LAM ,PPD 5IU皮试三种方法对 4 2例初治菌阴肺结核患者、4 6例初治菌阳性肺结核患者及 36例健康人进行检测。结果 :单项检测敏感性与特异性依次为LAM 6 7 4 % ,94 4 % ;PCR 95 7% ,97 2 % ;PPD 5 6 5 % ,97 2 %。单项检测对菌阴性肺结核的检出率分别为PCR 4 7 6 % ,LAM 31 0 % ,PPD 2 1 4 %。联合检测对菌阴性肺结核的检出率明显高于单项检测 ,联合检测特异性大于 90 %。结论 :三种方法联用对菌阴肺结核的检出率明显增加 ,特异性好 ,值得推广。

三种复合侵染‘心香’甘薯的病毒种类鉴定与分析

‘心香’是中国选育的一种优质鲜食早熟甘薯品种。利用小RNA深度测序技术和RT-PCR方法,对采集于海南省东方市1例表现为明显花叶斑驳及叶严重卷曲皱缩症状的‘心香’甘薯叶片进行感染病毒种类鉴定,发现样本中含有马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯病毒C(sweet potato virus C,SPVC)和乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)、麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)甘薯褪绿斑病毒(sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)。进一步基于病毒CP基因全长进化树分析结果表明,这3种病毒分离物分属于SPFMV RC株系、SPVCII株系和SPCFV非洲-秘鲁株系组。本研究鉴定出的复合侵染‘心香’甘薯的这三种病毒,将为该品种的病毒防控及脱毒种苗繁育提供理论基础。

HBV定量检测对拉米夫定停药的指导意义

目的:探讨核苷类似物(NAs)拉米夫定(LAM)用药时间与乙型肝炎(CHB)患者体内HBV病毒血清HBV-DNA载量的关系。方法:选取214例HBeAg阳性患者,在LAM(100 mg/d)的36个月用药治疗前使用实时荧光定量PCR进行血清HBV-DNA载量进行测定,并使用特异性引物鉴定HBV病毒DNA保守位点YMDD的抗药性突变以及病毒株的变化情况。结果:(1)214例患者均对LAM产生应答,在治疗12-18个月后血清HBV-DNA载量稳定在较低水平。(2)病毒株在NAs治疗前已经出现耐药性突变(18%),用药加速了HBV病毒的耐药进化,18个月后耐药病毒数在214例样本中均超过10%的检测标准。结论:LAM治疗在9-18个月获得良好的治疗效果,建议24个月后停药更换临床处方防止耐药病毒株的进化。