阿米洛利对PC12细胞的保护作用及其对LAMP2a表达影响

目的研究阿米洛利对PC12细胞的保护作用,及其对LAMP2a表达水平的影响。方法 pH 6.0的酸性培养液诱导PC12细胞损伤,同时给予阿米洛利进行干预,四甲基偶氮唑盐(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)和流式细胞技术检测细胞存活率、损伤程度及凋亡率,Western blot检测LAMP2a表达水平。结果酸性培养液处理24 h,细胞存活率降低至(67.2±5.1)%,上清液中的LDH增多至(407.9±11.1)U/L,凋亡率升高至(27.8±2.6)%。阿米洛利(100μmol/L)提高PC12细胞的存活率至(84.9±2.2)%,LDH降低至(314.1±5.2)U/L,细胞凋亡率降低至(17.8±1.3)%,与pH 6.0组相比(P<0.001)。酸处理导致LAMP2a表达升高,而阿米洛利能够显著抑制LAMP2a的表达(P<0.05)。结论阿米洛利通过下调LAMP2a的表达发挥神经保护作用。

电针对帕金森病模型大鼠脑黑质内Lamp2a、Hsc70、α-syn表达的影响

目的：观察电针对鱼藤酮诱导的帕金森病（Parkinson’s disease,PD）模型大鼠脑黑质内Lamp2a、Hsc70、α-syn表达的影响,探讨电针治疗帕金森病的可能作用机制。方法：雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针治疗组,每组15只。采取颈背部皮下注射鱼藤酮法制备帕金森病模型,假手术组只注射不含鱼藤酮的等量葵花油乳化液。正常组、假手术组、模型组不进行任何治疗;电针治疗组在造模完成后取穴＂风府＂、＂太冲＂,连续波,频率120次/min,每次治疗20 min,每天1次,疗程为28 d。免疫组化法检测模型大鼠黑质内TH、α-syn的阳性表达,并用Western blot法检测模型大鼠黑质内Lamp2a、Hsc70、α-syn的表达。结果：模型组大鼠表现出明显的PD症候群特征,电针干预后模型大鼠行为学评分明显降低（P〈0.01）;免疫组化法及Westernblot检测显示电针治疗通过上调Lamp2A、Hsc70水平能抑制错误折叠蛋白α-syn的表达,提高TH的阳性表达。结论：电针可以抑制具有细胞毒性作用的α-syn的集聚,保护多巴胺能神经元,抑制帕金森病的发展,其机制可能与干预分子伴侣介导的自噬有关。

黑质LAMP2A过表达改善帕金森病恒河猴模型的运动功能

目的在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)恒河猴模型上观察黑质过表达溶酶体相关膜蛋白2A(lysosome associated membrane protein 2A,LAMP2A)上调分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)对实验猴运动行为的影响。方法应用立体定位注射仪向7只恒河猴的右脑纹状体区注射PD患者死亡后脑组织(自愿捐献)的路易小体(Lewy bodies,LBs)提取物,同时在左脑纹状体区注射非PD病人死亡患者的脑组织(自愿捐献)提取物来构建PD恒河猴模型。模型动物随机分为两组,LAMP2A过表达组(4只)在其黑质区双侧注射过表达LAMP2A的腺相关病毒载体;对照组(3只)在黑质区双侧注射对照病毒载体。通过阶梯实验、平板取食实验评价PD恒河猴模型运动能力和LAMP2A对该PD模型运动功能的影响。利用ELISA法对实验猴脑脊液、血清的总α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)及磷酸化α-syn水平进行测定。结果阶梯实验和平板取食实验中对照组恒河猴的左侧上肢的精细动作水平相较于其右侧出现下降;LAMP2A过表达组恒河猴的左右两侧上肢的精细运动水平没有出现明显差异;ELISA测定对照组术后12月脑脊液、血清的总α-syn水平及磷酸化α-syn水平显著增高;LAMP2A过表达组脑脊液磷酸化α-syn水平和血清磷酸化α-syn水平在8月之后均低于同期的对照组。结论过表达LAMP2A可能通过增加α-syn的CMA清除改善PD恒河猴模型精细运动能力。

基于LAMP2A介导的自噬探讨仙鹤草-黄连含药血清对结直肠癌细胞的作用及机制研究

探讨仙鹤草-黄连(Agrimoniae Herba-Coptidis Rhizoma,XHC-HL)含药血清通过溶酶体相关膜蛋白2A型(lysosome-associated membrane protein type 2A,LAMP2A)介导的自噬对人结直肠癌HT29和HCT116细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。通过生物信息学分析LAMP2A在结直肠癌发生发展中的作用机制;蛋白免疫印迹(Westem blot,WB)检测LAMP2A蛋白在结直肠癌细胞株中的表达;利用慢病毒转染技术构建LAMP2A干扰HT29及过表达HCT116结直肠癌细胞模型;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time qPCR)实验检测转染效率;结直肠癌HT29和HCT116细胞分别给予不同浓度的仙鹤草-黄连含药血清,采用cell counting kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖,筛选含药血清最佳干预浓度及时间。将HT29细胞分为空白对照(NC)组、XHC-HL(仙鹤草-黄连药对处理)组、XHC-HL+shLAMP2A(仙鹤草-黄连药对处理+干扰LAMP2A)组;将HCT116细胞分为空白对照(NC)组、XHC-HL(仙鹤草-黄连药对处理)组、XHC-HL+LAMP2A(仙鹤草-黄连药对处理+过表达LAMP2A)组,CCK-8检测细胞活力;平板克隆实验检测细胞增殖能力;划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;WB技术和real-time qPCR技术检测仙鹤草-黄连药对对结直肠癌细胞LAMP2A、热休克同源蛋白70(heat shock cognate protein 70,HSC70)、热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的蛋白表达水平及mRNA的影响。通过差异表达分析发现结直肠癌患者相对于正常对照样本的LAMP2A表达水平有显著升高,生存分析提示伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)关键分子LAMP2A与结直肠癌的进展密切关联,通过基因集功能富集分析发现LAMP2A高表达患者显著上调了血管生成、免疫抑制等肿瘤进展相关信号通路,且免疫浸润分析发现LAMP2A高表达患者的肿瘤微环境会有更少的CD8 T细胞浸润。仙鹤草-黄连含药血清可以抑制HT29和HCT116细胞活力,最佳干预质量分数及时间为20%、48 h。与NC组相比,仙鹤草-黄连药对均可抑制HT29和HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,药对处理干扰LAMP2A组均能进一步抑制肠癌细胞增殖、侵袭及迁移能力并促进凋亡,而过表达LAMP2A可逆转含药血清处理后结直肠癌细胞被抑制的增殖、迁移、侵袭能力,减少细胞凋亡率。仙鹤草-黄连药对含药血清对CMA具有抑制作用,通过LAMP2A介导的自噬,上调LAMP2A、HSC70、HSP90蛋白和基因的表达,下调底物蛋白GAPDH的表达发挥抗结直肠癌功能。综上,仙鹤草-黄连药对可通过下调CMA关键分子蛋白LAMP2A表达,抑制CMA活性,从而抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭,并诱导细胞凋亡。

LAMP2A和MEF2D在增龄过程中大鼠髓核组织的表达及其意义

目的 探讨在增龄过程中SD大鼠髓核组织中LAMP2A和MEF2D的表达及其意义.方法 3、12、24月龄SD大鼠各8只,建立青年大鼠组、中年大鼠组和老龄大鼠组模型,透射电镜检测髓核细胞中自噬体的表达 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法测定髓核组织中LAMP2A和MEF2D的表达.结果 不同年龄组大鼠髓核细胞中均有自噬体的表达 RT-PCR和Western blot法显示LAMP2A在3、12、24月龄组中均有表达（0.91±0.07、1.12±0.11、1.32±0.28和0.45±0.06、0.55±0.08、0.63±0.11）,且在老龄组表达较青年组表达明显增高（P＜0.01和P＜0.05）,在3、12、24月龄组中,RT-PCR和Western blot法亦显示MEF2D均有表达（0.66±0.10、0.55±0.08、0.52±0.08和0.46±0.03、0.43±0.02、0.41±0.04）,且24月龄组表达明显较青年组低（P均＜0.01）.结论 自噬存在于椎间盘退变过程中 分子伴侣介导的自噬活性的增加可能与椎间盘退变的发展进程有关.LAMP2A介导的分子伴侣自噬性细胞死亡可能通过MEF2D进行调节.

Lamp2a参与Plin5在肝脏脂质分解中的作用

目的:探讨肝脏中lamp2a对plin5表达及其功能的影响。方法:利用Western blot及免疫组化检测正常人和脂肪肝患者肝脏中lamp2a与plin5表达相关性。利用HepG2细胞构建lamp2a敲减的细胞系HepG2-L2A,通过给予油酸刺激、溶酶体抑制剂处理等进一步在细胞水平证实其相关性。结果:Western-Blot及免疫组化检测显示脂肪肝患者肝组织中lamp2a的表达明显下降,而plin5表达显著升高。Western-Blot试验提示正常培养的HepG2-L2A细胞中plin5表达较HepG2细胞中升高,Bodipy染色提示HepG2-L2A细胞中脂滴数量也明显增加(124±15.3 vs 273±19.1)。在分解试验中,HepG2细胞中plin5明显降低,脂滴数量也明显减少(282±24.1 vs 192±17.5);而HepG2-L2A细胞中plin5仍然处于高水平,脂滴数量仍然较多(325±24.0 vs 286±28.7)。当给予溶酶体抑制剂处理时,HepG2细胞中plin5降解明显抑制,而HepG2-L2A中plin5水平未见明显改变。结论:肝脏中lamp2a的异常表达影响plin5的表达,进而影响了脂质的分解。

槲皮素对慢性酒精暴露小鼠肝脏自噬的调控

目的探讨慢性酒精暴露对肝脏溶酶体自噬的影响及槲皮素的拮抗效应。方法成年♂C57BL/6J小鼠按体质量随机分为4组,即正常对照组(Con)、酒精组(Eth)、酒精+槲皮素组(Eth+Qu)、槲皮素对照组(Qu)。各组小鼠等能量配对喂养15周,检测肝脏损伤相关指标、溶酶体损伤及自噬标志蛋白的表达。结果与正常对照组相比,长期酒精摄入引起肝脏严重的脂质沉积、氧化损伤(MDA水平明显升高,而GSH水平明显降低)、血清ALT、AST水平明显增加;肝细胞中自噬体标志蛋白LC3-II及自噬底物蛋白p62异常升高;Lyso-Tracker Red染色后,酒精组肝脏荧光强度明显减弱,胞质中cathepsin B活性明显升高;此外,自噬体与溶酶体融合关键蛋白溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)的表达也明显下降;槲皮素干预减轻了溶酶体损伤、改善了自噬体的积累,降低了LC3-II与p62的蓄积,促进了自噬体与溶酶体的融合,同时上调LAMP2A的表达,肝脏损伤明显缓解。结论槲皮素可能通过减轻溶酶体损伤、上调自噬体与溶酶体融合关键蛋白LAMP2A水平,缓解慢性酒精暴露所致肝脏自噬抑制,从而减轻酒精性肝损伤。

类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞分子伴侣介导自噬增强与病情的相关性

目的检测类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLS)分子伴侣介导自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)水平,探究其与RA病情发生发展的关系。方法从手术室中收取8例RA患者膝关节滑膜组织,培养原代滑膜细胞;同期收取8例骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者膝关节滑膜组织,培养骨关节炎滑膜成纤维细胞(osteoarthritis fibroblast-like synoviocytes,OA-FLS)作为对照。采用RT-qPCR检测RA-FLS与OA-FLS中CMA标志性因子Hsc70、LAMP2A mRNA水平;Western blot法检测两组细胞中Hsc70、LAMP2A蛋白水平。采用免疫荧光细胞化学染色检测RA-FLS中Hsc70、LAMP2A蛋白及共定位表达。采用Pearson法分析Hsc70、LAMP2A蛋白与RA患者临床指标DAS28、血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、类风湿因子(rheumatoid factor,RF)的相关性。结果RA-FLS组Hsc70与LAMP2A mRNA(1.05±0.15和1.01±0.06)和蛋白水平(1.02±0.08和1.07±0.03)均明显高于OA-FLS(分别为0.51±0.10和0.63±0.08、0.78±0.06和0.61±0.08)对照组(P<0.05);免疫荧光结果显示,RA-FLS中代表Hsc70蛋白的红色荧光和代表LAMP2A蛋白的绿色荧光明显更强,红绿荧光融合后的黄色荧光斑点也显著高于对照组。Pearson相关性分析结果显示,Hsc70蛋白水平与RA患者DAS28得分呈正相关(r=0.7756),LAMP2A蛋白水平与RA患者DAS28得分、ESR呈正相关(分别r=0.7507、r=0.7790)。结论RA患者Hsc70、LAMP2A表达上调,CMA途径被激活,且与RA患者的病情活动度呈正相关。

溶酶体相关膜蛋白2AshRNA对乳腺癌细胞株紫杉醇耐药的影响

目的制备针对人溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)的shRNA重组慢病毒,获得稳定低表达LAMP2A的MDA-MB-231乳腺癌细胞株,观察LAMP2A分子下调对乳腺癌细胞紫杉醇耐药性的影响。方法通过对LAMP2A的mRNA序列分析,设计了4条shRNA,通过基因重组技术构建pGLV-EGFP-shRNA慢病毒表达质粒,并测序鉴定。将构建的表达质粒和包装质粒共转染人胚肾HEK293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将构建的shRNA慢病毒表达载体感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株后,Western blot法检测LAMP2A表达,验证蛋白表达抑制效果。采用1 nmol/L、10 nmol/L、100nmol/L的紫杉醇处理LAMP2A低表达乳腺癌细胞株后,用MTT法观察LAMP2A低表达组和对照组之间增殖效率的差异。结果测序结果显示重组慢病毒质粒构建正确,病毒滴度达2×108TU/mL。乳腺癌稳定细胞株中LAMP2A蛋白表达量显著降低。在10 nmol/L、100 nmol/L紫杉醇处理后,LAMP2A低表达乳腺癌细胞株对紫杉醇耐药性明显降低(P<0.05)。结论成功构建了人的LAMP2A基因shRNA慢病毒载体,获得了稳定低表达LAMP2A的乳腺癌细胞株,证实LAMP2A下调能够降低乳腺癌细胞株对紫杉醇的耐药性。

以孤立肌肉病为首发症状的Danon病2例临床分析

目的报道2例以孤立肌肉症状起病的Danon病,以提高对该病的认识.方法收集2例基因确诊的LAMP2基因突变所致的Danon病患者的临床、影像学、病理和基因检测资料,并随访患者至确诊后2年,结合文献综合分析.结果2例患儿均为男性,起病年龄分别为5岁和4岁,就诊年龄分别为9岁5个月和4岁10个月.起病前运动发育里程碑均正常.例1主诉"发现肌无力4年余",例2主诉"肢体乏力10月余".2例患者血氨基酸和肉碱谱分析、尿有机酸筛查均未见异常.超声心动图均正常.例1肌肉活检可见肌纤维内自噬性空泡,超微病理检查示肌纤维膜下糖原颗粒增多.遗传性肌病基因筛查证实2例患者均存在LAMP2基因c.877C>T(p.Arg293Ter)无义变异(已报道的致病变异).例1为新发突变,例2无症状母亲为杂合变异.随访患者2年,例1心脏超声心动图正常,心电图轻度异常,肌无力症状稳定.例2在确诊10个月后失访.结论孤立性肌肉病变可以是儿童Danon病的早期临床表现之一.加强对LAMP2基因变异所致肌肉病患者的认识,密切监测心脏功能,有助于改善患者的预后.

Danon病与心脏表现相关的研究进展

Danon病是一种X连锁显性遗传性溶酶体病,以心肌肥厚、骨骼肌病和智力障碍为主要临床表现。随着组织学的发展,最初认为其肌肉组织的表现类似Pome病;表现为一种溶酶体相关疾病,被称为糖原累积病IIb型[1]。直到2000年,Nishino等[2]第一次报道了LAMP2基因突变会导致Danon病。因男性表现为LAMP2半合子基因,故该病在男性中发病较多,临床症状更为严重。而女性则较少发病,表现较为轻微。Danon病患者预后差。我们认为由于对Dannon病的认识不足,导致有一定数量的该病患者被漏诊。本文通过对相关文献的学习,提供全面的临床资料,为临床医生提供Danon病的诊断与管理指南。

自噬-溶酶体标记基因LC3B和LAMP2调控序列变异与退行性心脏瓣膜病的关联性

目的探索自噬-溶酶体标记基因LC3B和LAMP2调控序列变异与退行性心脏瓣膜病(DHVD)的关联性。方法对212例DHVD患者组与390例健康对照组的自噬-溶酶体系统标记基因LC3B和LAMP2调控序列(启动子)进行统计分析。采集研究对象的外周静脉血白细胞,提取基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增基因LC3B和LAMP2的启动子序列,Sanger测序法直接检测序列变异。运用卡方检验对单核苷酸多态性(SNPs)进行分析,TRANSFAC数据库预测序列变异改变与启动子相结合的转录因子。结果共发现29个序列变异,包含13个SNPs。其中,6个LC3B基因启动子序列变异仅发现于DHVD患者,1个LAMP2基因启动子序列变异只存在于DHVD女性患者,其他序列变异在健康对照组和患者组共有。对SNPs的基因型和等位基因进行卡方检验和logistic回归分析显示,rs35227715的等位基因G与DHVD相关联,是DHVD的独立危险因素,致病风险是1.36倍;rs42900基因型CC和等位基因C与DHVD存在关联,两者的致病风险均为0.56倍,具有保护性作用。利用TRANSFAC数据库预测仅在DHVD患者中发现的序列变异位点相结合的转录因子,结果表明序列变异可改变与之结合的转录因子。结论自噬-溶酶体系统标记基因LC3B和LAMP2启动子序列变异可能影响与之结合的转录因子,改变其表达水平,引起自噬-溶酶体系统的功能失调,从而导致DHVD的发病。

LAMP2抑制肝癌细胞增殖的机制

目的:探索LAMP2分子对肝癌细胞增殖的影响及其机制。方法:首先利用Western blot及QT-PCR技术检测在不同肝癌细胞系中LAMP2分子的表达水平,然后选择一种肝癌细胞系HepG2进行慢病毒转染以建立LAMP2沉默的稳定细胞系HepG2-9455。利用MTT法对比LAMP2沉默细胞系和未沉默细胞系细胞的增殖情况。检测其可能影响的几个关键信号通路分子如PI3K、AKT、NF-κB、ERK等以明确其作用机制。结果:LAMP2在各肝癌细胞系中普遍表达较高,其在正常肝组织中主要分布于胆管周围并且呈极性分布,然而在肝癌组织中LAMP2的定位却发生了紊乱。通过慢病毒构建的稳定细胞系HepG2-9455其LAMP2表达下降了90%,而在下调LAMP2后可以显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖。并且在下调LAMP2分子后HepG2细胞的PI3K、AKT和NF-κB分子发生明显下调。结论:LAMP2分子可以通过调节下游的PI3K、NF-κB(pp65)分子而影响肿瘤细胞的增殖。提示LAMP2分子在肝癌的恶性进展中可能发挥了重要的作用。

与前列腺癌恩杂鲁胺耐药相关铁死亡基因的生物信息学分析

目的基于生物信息学方法分析与前列腺癌恩杂鲁胺耐药相关的铁死亡差异表达基因。方法从基因表达数据库(GEO)中下载恩杂鲁胺耐药与未耐药的前列腺癌细胞测序基因集(GSE104935、GSE78201),筛选差异表达基因;通过FerrDb数据库收集铁死亡相关基因。通过ImageGP维恩图工具将GEO数据库中差异表达基因及FerrDb数据库中铁死亡相关基因取交集,获得铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的差异表达基因。将筛选出来的差异表达基因通过R软件进行GO功能(包括生物过程、分子功能、细胞成分)和KEGG作用通路富集分析。选取美国癌症研究所及美国人类基因组研究所收集处理的关于前列腺癌的测序数据和临床数据(TCGA-PRAD),通过R软件对铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因进行临床预后的单因素、多因素Cox回归分析,获得铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的预后标志基因。用R软件在TCGA-PRAD队列中分析铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌预后标志基因的表达水平,Kaplan-Meier法比较预后标志基因高、低表达者的总生存期(OS)、无进展生存期(PFI)和疾病特异性生存期(DSS)。利用R软件绘制预测患者1、3、5年OS、PFI的受试者工作特征(ROC)曲线,通过曲线下面积(AUC)评价预测价值。结果从GEO、FerrDb数据库中共筛选获得铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的差异表达基因31个。GO功能分析显示,铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因主要富集的生物过程为营养水平反应、细胞对外界刺激的反应、氧化应激反应等,主要富集的细胞成分为自噬体膜、次级溶酶体、自噬体等,主要富集的分子功能为类固醇脱氢酶活性、醛醇NADP+1-氧化还原酶、酰CoA连接酶活性等;KEGG作用通路分析显示,铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因主要富集的作用通路为花生四烯酸代谢、自噬、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等。单因素、多因素Cox回归分析显示,LAMP2为铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的预后标志基因。TCGA-PRAD队列中,LAMP2在前列腺癌组织中相对表达量低于正常组织(P<0.01),LAMP2低表达者OS、PFI均低于高表达者(P均<0.05),DSS与高表达者差异无统计学意义。ROC曲线结果显示,LAMP2预测前列腺癌患者1、3、5年OS的AUC分别为0.825、0.747、0.770,预测前列腺癌患者1、3、5年PFI的AUC分别为0.539、0.601、0.568。结论LAMP2、VEGFA、ACSF2等铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌差异表达基因主要富集在营养水平反应、细胞对外界刺激的反应、氧化应激反应等功能及花生四烯酸代谢、自噬、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等作用通路。LAMP2为铁死亡相关恩杂鲁胺耐药前列腺癌的预后标志基因,LAMP2异常低表达是前列腺癌患者预后不良的独立危险因素,其对患者预后具有良好的预测价值。

miR-145-3p在多发性骨髓瘤中表达及其对多发性骨髓瘤细胞凋亡与自噬作用机制的研究

目的探讨微小m RNA-145-3p(miR-145-3p)在多发性骨髓瘤(MM)中表达及其对MM细胞凋亡与自噬作用机制。方法 2014年6月至2017年5月我院收治的MM患者60例(MM组)、健康体检者30例(正常组),采用荧光定量PCR法检测两组血浆样本及细胞株(MM细胞株选择U266、RPMI-8266、LP-1、H929,以CD138+浆细胞为对照组)中miR-145-3p表达水平,后选择毒性最低的MM细胞株(LP-1)进行miR-145-3p mimic或inhibitor转染(分别为mimic组、inhibitor组),并设立对照,以流式细胞仪进行凋亡检测[吸光度值(OD值)],并采用westren blot检测转染细胞凋亡与自噬相关标志物[肿瘤蛋白21(P21)、unc-51样激酶1(ULK1)、溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)]。结果 MM组血浆及细胞株(U266、RPMI-8266、LP-1、H929)中miR-145-3p水平均低于正常组(P <0. 05);转染后随时间延长,OD值均增加,且转染后3 d及5 d OD值大小均为mimic组<对照组<inhibitor组; mimic组P21水平高于inhibitor组及对照组,ULK1、LAMP2水平低于inhibitor组及对照组(P <0. 05)。结论 miR-145-3p在MM中呈低表达,可能通过靶向调控P21/ULK1/LAMP2信号通路而抑制细胞凋亡,促进细胞自噬。

补阳还五汤对自噬相关蛋白LAMP2的影响

目的研究补阳还五汤对脑缺血后大鼠LAMP2蛋白表达的影响。方法2019年7月16日—2019年7月30日用改良线栓法制备大鼠中动脉栓塞模型,将50只大鼠随机分成5组,以补阳还五汤不同浓度进行灌胃治疗,每天灌胃1次,造模前灌胃7天,造模后继续灌胃7天。取造模后大鼠脑细胞用Western blot法进行LAMP2蛋白表达测定。探讨不同浓度补阳还五汤对LAMP2蛋白表达的影响。结果假手术组LAMP2蛋白表达水平明显高于模型组、常规、2倍及10倍剂量组,差异有统计学意义(P<0.01)。模型组LAMP2蛋白表达水平明显低于假手术组、2倍及10倍剂量组(P<0.01)。假手术组LAMP2表达水平最高,模型组最低,模型组与假手术组、2倍剂量组、10倍剂量组比较,差异有统计学意义(P<0.01),与常规剂量组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论补阳还五汤常规剂量治疗基本无效,10倍剂量组对脑缺血后大鼠的治疗效果确切有效。补阳还五汤可能通过上调LAMP2蛋白的表达使CMA活性上调进而发挥神经保护作用。

补阳还五汤对脑缺血后大鼠脑神经功能的影响

目的探讨补阳还五汤对脑缺血后大鼠神经功能的影响。方法采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型,补阳还五汤灌胃后以Longa 5级4分法评价模型的神经功能缺失症状。神经功能评分后断头取出鼠脑,采用实时荧光定量PCR扩增LAMP2基因。结果术后第7天,补阳还五汤灌胃治疗后大鼠神经功能得到一定程度的恢复,各组间评分和恢复程度有差异。LAMP2 mRNA正常组、低剂量组、中剂量组、高剂量组mRNA相对表达水平较模型组均上调(均P<0.01)。正常组表达量最高,高剂量组高于中剂量组,中剂量组高于低剂量组,低剂量组大于模型组(均P<0.01)。结论补阳还五汤能通过上调LAMP2表达影响CMA的活性,进而启动自噬调控机制改善脑缺血后大鼠的神经功能。

三阴性乳腺癌中溶酶体相关膜蛋白-2表达水平的临床意义及预后价值

目的探讨溶酶体关联膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2,LAMP2)表达水平与三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)患者临床病理特征及其预后的关系。方法收集2015年1月至2017年1月在新疆医科大学附属肿瘤医院院确诊并行乳腺癌根治术的104例TNBC患者的临床病理资料,调取患者冻存癌组织及癌旁组织标本,使用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测TNBC癌组织及癌旁组织中LAMP2表达,验证LAMP2表达水平与TNBC患者的临床病理特征及总生存(overall survival,OS)的关系。使用单因素及Cox多因素回归分析TNBC患者的预后因素。结果WB实验结果显示,LAMP2在TNBC癌组织中表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。LAMP2表达与TNBC患者TNM分期、淋巴结转移及组织学分级相关,结果有统计学差异(P均<0.05)。生存分析结果显示,截至2022年1月25日,LAMP2高表达组5年生存率显著低于低表达组(P<0.05)。单因素及Cox多因素回归分析:TNM分期及LAMP2表达水平是TNBC患者独立预后因素,结果有统计学差异(P<0.05)。结论LAMP2在TNBC癌组织及癌旁组织中差异表达,LAMP2高表达可能与患者TNM分期、淋巴结转移及组织学分级相关,更高的LAMP2的表达可能预示着患者更差的预后。

LAMP2单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗-lamp2单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步鉴定。方法:根据已发表的文献通过人工合成多肽,并将此多肽分别连接KLH和BSA,以peptide-KLH作为抗原免疫BALB/c小鼠,取血清效价大于1:10000的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以peptide-BSA包被,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测杂交瘤细胞的上清进行筛选;得到能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类,采用免疫组化方法证明新制备的单克隆抗体能识别目的蛋白。结果:得到一株能稳定分泌抗-LAMP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,压用免疫组化方法证明新制备的抗-LAMP2单克隆抗体能识别天然的LAMP2;此单克隆抗体的亚类为。结论:杂交瘤细胞株能稳定分泌目的单克隆抗体;免疫组化方法证明新制备的单克隆抗体能识别自己天然的目的蛋白,为更好地研究LAMP2的生物学功能奠定了基础。

LAMP2 is involved in estrogenic deficiency induced spatial memory impairment through autophagy-AB pathway

LAMP2(lysosome associated membrane glycoprotein 2)is an important autophagy protein but its role in estrogenic regulation on spatial learning and memory remains unclear.In this study,we first infused aromatase(estrogen synthase)-specific RNA interference AAV into the hippocampus of mice,label-free quantitative proteomics analysis revealed that LAMP2 was the most significantly upregulated protein.This upregulation was further proved with RT-PCR,WB,IHC in ovariectomy(OVX)mice.Then,LAMP2-overexpressing(oLAMP2)and RNA interference(shLAMP2)virus vectors were injected into the hippocampus of OVX mice,respectively.