Inhibitory effect of lanosterol on cataractous lens of cynomolgus monkeys using a subconjunctival drug release system Keke

Background:To evaluate the effect of lanosterol on cataractous lens of cynomolgus monkeys using a subconjunctival drug release system.Methods:Nine elder cynomolgus monkeys were used,consisting of three monkeys without cataract as controls,three monkeys with naturally occurring cortical cataract,and three monkeys with nuclear cataract as intervention groups.Nanoparticulated thermogel with lanosterol and fluorescein was administered by subconjunctival injection in the monkeys with cataract.Fluorescence changes of injected thermogel and cataract progression were observed.Lanosterol concentration in aqueous humor,solubility changes in lens proteins,and oxidative stress levels were analyzed in the lenses of the control and intervention groups.Results:Injected thermogel showed decreased fluorescence during follow up.Lanosterol concentration in aqueous humor increased in the first 2 weeks and then gradually decreased,which was in accordance with the changes in cortical lens clarity.However,lenses with nuclear opacification showed little change.In the cortical region of lenses with cortical cataract,solubility ofα-crystallin was significantly increased after administration of lanosterol,as well as the reduction of oxidative stress.Conclusions:We demonstrated the effect of lanosterol on cataract progression based on in vivo models of primates.Lanosterol showed a short-term and reliable reversal effect on reducing cataract severity in cortical cataract in the early stages,possibly due to the increase in the solubility of lens proteins and changes in the oxidative stress status.Lanosterol administration using subconjunctival drug release system could be a promising nonsurgical approach for future clinical studies of cataract prevention and treatment.

高效液相色谱法测定桦褐孔菌4种成分含量及不同部位含量比较

目的评价桦褐孔菌药材质量,建立高效液相色谱(HPLC)法测定桦褐孔菌药材中4种成分含量,并比较不同部位4种成分含量的差异。方法采用HPLC法测定桦褐孔菌中栓菌酸、桦褐孔菌醇、麦角甾醇、羊毛甾醇含量,并对桦褐孔菌药材黑褐色外壳和内部黄色菌肉中4种成分含量进行比较。色谱柱为Agilent 5 TC-C 18(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温30℃;以乙腈-水为流动相,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1);检测波长为203,282 nm;进样量:20μL。采用SPSS23.0版统计软件对不同产地桦褐孔菌药材进行聚类分析,对内外两部位含量进行统计学分析。结果4种成分在各自浓度范围内线性关系良好(r≥0.9997);平均加样回收率分别为101.79%,102.96%,101.12%和101.37%,RSD分别为2.35%,2.25%,2.27%和2.13%(n=6);精密度、重复性、稳定性(24 h)实验RSD均<3.0%(n=6);23批桦褐孔菌药材中栓菌酸、桦褐孔菌醇、麦角甾醇、羊毛甾醇含量范围分别为0.3830~3.5234,0.7412~6.4903,0.1288~0.6997,0.6289~4.0533 mg·g^(-1);聚类分析可将23批样品分为3类。桦褐孔菌药材内部菌肉中麦角甾醇、羊毛甾醇含量高于黑褐色外壳,而栓菌酸、桦褐孔菌醇含量在桦褐孔菌内外两部位之间差异无统计学意义。结论所建立的含量测定方法重复性、稳定性、可操作性良好,可为桦褐孔菌药材的质量控制提供参考。

大肠杆菌羊毛甾醇合成途径的构建与优化

三萜类化合物是一类具有高附加值的次生代谢产物,羊毛甾醇是其生物合成的重要骨架化合物。为了在大肠杆菌中构建羊毛甾醇合成途径,将酵母来源的鲨烯合酶,荚膜甲基球菌来源的鲨烯环氧酶和氧化鲨烯环化酶分别克隆到载体pET28a(+)和pCDF-DUET-1中,共转入大肠杆菌BL21(DE3)底盘细胞,获得了羊毛甾醇生产菌株BT-tSSE-DXOSC。通过过表达甲基赤藓糖醇磷酸(2-C-methyl-D-erythrito-4-phosphate, MEP)途径关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶和法尼基焦磷酸合酶,增加了前体供应,使羊毛甾醇产量达2.39 mg/L,较优化前提高了2.1倍。通过发酵条件优化,确定了最优pH为7.5,诱导剂IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导温度30℃,获得羊毛甾醇产量为5.12 mg/L,较初始条件提高了1.1倍。该研究首次构建了产羊毛甾醇的大肠杆菌工程菌株,为以羊毛甾醇为中间体的三萜类物质生物合成及相关代谢途径的研究搭建了平台。

桦褐孔菌的化学成分及抗炎活性

本实验研究了桦褐孔菌的化学成分及其抗炎活性。方法是采用溶剂法和柱色谱法提取分离桦褐孔菌的化学成分,根据化合物的理化性质及核磁共振氢谱、碳谱、质谱对其化学结构进行鉴定,然后采用二甲苯致小鼠耳肿胀和二甲苯致小鼠腹膜炎模型对所得化合物的抗炎活性进行考察。最终从桦褐孔菌的乙醇提取物中分离得到3个羊毛脂烷型三萜类化合物,分别鉴定为羊毛甾醇(1)、inotodiol(2)和trametenolic acid(3)。化合物1、2、3在10 mg/kg均显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀,化合物1和2在10 mg/kg时显著降低血管通透性。由此得出化合物1～3均有抗炎活性,其中trametenolic acid(3)的抗炎活性最强。

氮唑类抗真菌药物药效构象及其与酶活性位点对接

目的：研究氮唑类抗真菌药物与其受体蛋白活性位点相互作用机理。方法：用随机构象搜寻和分子动力学模拟退火法确定１５个４种不同类型的氮唑类抗真菌药物最低能量构象；用活性类似物法限定药物分子药效基团之间的距离，搜寻到各化合物药效构象；将各化合物药效构象对接到白色念珠菌羊毛甾醇１４α去甲基化酶活性位点中。结果：４种结构类型的氮唑类药物在酶活性位点中有相似的对接位置；真菌和哺乳动物的活性位点结构特异性的残基分布在Ｆ螺旋Ｃ端、β６１和β６２区中；氮唑类抗真菌药物共同的卤代芳环结构落入相同的疏水空穴中，其中Ｙ１３２的侧链羟苯基结构可与抑制剂卤代芳环形成电子迁移复合物。结论：对接结果与已知ＳＡＲ分析结论相符，阐明了氮唑类药物与活性位点的氨基酸残基作用方式，探讨结构选择性药物的结构需求。

抗真菌药物的创新设计研究

运用计算机辅助药物设计技术和分子生物学技术,建立了一套集分子设计、化学合成和分子筛选三大系统为一体的抗真菌药创新设计体系。其工作原理是:通过药效构象搜寻、3D-QSAR研究,建立了抗真菌药物与受体作用模型,预测设计高活性化合物;另一方面,根据抗真菌药靶酶——羊毛甾醇14α-去甲基化酶的已知序列,采用同源蛋白模建技术构建其三维结构,再通过药物-靶酶对接研究,确定活性位点,设计与活性位点最佳匹配的活性化合物;然后针对设计的化合物类型,研究建立一套科学的合成方法,完成化合物的合成;最后以靶酶为模型,建立一套快速准确的分子筛选方法,用筛选结果指导进一步的设计与合成,直至得到最佳的新化学单体(NCE)。将该体系用于抗真菌药物设计,获得了一个广谱、高效、低毒的抗真菌新药——艾迪康唑。

反相高效液相色谱法分析禾谷丝核菌菌丝中麦角甾醇和羊毛甾醇的含量

采用反相高效液相色谱法,建立了检测禾谷丝核菌中麦角甾醇和羊毛甾醇含量的方法。样品经过破碎、离心、皂化后定量测定。采用DiamonsilTMC18色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d,5μm i.d.),流动相为100%甲醇,流速为1 mL/min,紫外检测波长为210 nm,保留时间定性,外标法定量。麦角甾醇和羊毛甾醇的保留时间分别为21 min和27min。麦角甾醇在0.125-12.5 mg/L、羊毛甾醇在0.1-10.0 mg/L范围内,两者峰面积与浓度均呈线性关系,相关系数分别为0.9993和0.9983。添加回收率实验表明,2种甾醇的平均添加回收率为91.8%-99.7%;相对标准偏差为2.8%-7.8%;麦角甾醇和羊毛甾醇的最小检出量分别为1.0和0.8 ng,最低检出浓度分别为0.05和0.04 mg/L。本方法准确、简便、重现性好。

葛根素对膳食诱导的高胆固醇血症大鼠的血脂调节作用

目的:观察葛根素对膳食诱导的高胆固醇血症大鼠的血脂调节作用,并对其机制进行探索。方法:SD大鼠随机分为3组,正常组、模型组和葛根素组。模型组和葛根素组均给予富含胆固醇的饲料4周,葛根素组每天灌喂葛根素溶液(300mg·kg-1·d-1)。检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)的含量。荧光定量RT-PCR分析羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR),羊毛固醇14α-去甲基酶(CYP51),7α-羟化酶(CYP7A1)的mRNA转录水平。结果:葛根素显著降低高胆固醇膳食引起的血清胆固醇的升高,降低动脉粥样硬化指数,上调CYP7A1的mRNA转录水平,对HMGR和CYP51的转录水平没有影响。结论:这些数据表明葛根素能够降低血清胆固醇,减低动脉粥样硬化发生危险。其降低胆固醇的作用可能是通过促进胆固醇转化为胆酸实现的。

抗真菌药物作用靶酶羊毛甾醇14α去甲基化酶研究

羊毛甾醇１４α去甲基化酶是普遍存在于高等植物、真菌和哺乳动物体内的Ｐ４５０蛋白，是氮唑类抗真菌药物作用靶酶．到目前为止已分别确定了高等植物、真菌和哺乳动物体内该酶的氨基酸序列．该酶对底物的催化包括三个单加氧步骤，涉及自由基的生成和消除，血红素辅基在酶催化过程中起重要作用．底物羊毛甾醇只能结合在酶活性位点血红素辅基Ｎｃ吡咯环上方，其余血红素吡咯环被氨基酸残基封闭．底物羊毛甾醇的３β羟基、Δ８（９）双键和１７位侧链是与酶活性位点正确结合的关键官能团．

薄层色谱扫描法检测氟康唑对真菌麦角固醇生物合成的影响

目的：用薄层色谱扫描法检测抗真菌药物氟康唑对真菌麦角固醇生物合成的影响。方法：真菌与不同浓度氟康唑温育２４ｈ后计数、称量、皂化，提取真菌中难皂化脂，薄层层析，扫描测定其中的麦角固醇和羊毛固醇含量。结果：随着氟康唑浓度的增加，真菌中的麦角固醇含量逐渐减少，而羊毛固醇含量迅速增加。当抑制８５％的麦角固醇生物合成时，真菌生长繁殖的受抑率也在８５％左右。结论：薄层色谱扫描法能准确测定真菌中的麦角固醇和羊毛固醇含量，可用于考察抗真菌药物对真菌麦角固醇生物合成的影响。

羊毛甾醇合酶及羊毛甾醇在大鼠角膜、晶状体和视网膜组织中的分布

目的 已有研究证实与羊毛甾醇结构相似的三萜类化合物对于全身多种疾病具有治疗作用，近年来发现羊毛甾醇合酶（LSS）及羊毛甾醇对白内障具有治疗作用，但羊毛甾醇及其抑制剂与其他眼病的关系尚不清楚。了解羊毛甾醇在眼组织中的分布有助于阐明其与眼病的关系。目的 研究正常大鼠角膜、晶状体和视网膜中LSS及羊毛甾醇的表达及分布，为相关眼科疾病的靶向治疗提供依据。方法 取SPF级雄性SD大鼠15只，采用戊巴比妥钠过量麻醉法处死实验大鼠，立即摘取眼球，分别采用Western blot和逆转录（RT）-PCR法检测大鼠角膜、晶状体和视网膜组织中LSS蛋白及其mRNA的表达情况；采用免疫荧光化学法对LSS在角膜、晶状体和视网膜组织中的表达进行定位；采用液相色谱－质谱联用仪（LC-MS）检测羊毛甾醇在正常大鼠角膜、晶状体和视网膜组织中的含量。结果 Western blot法检测显示，大鼠视网膜中无LSS蛋白表达，LSS蛋白在晶状体组织的相对表达量为0.43±0.05，明显高于角膜组织中的0.25±0.03，差异有统计学意义（t＝－5.35，P〈0.01）。RT-PCR结果显示，正常大鼠视网膜中无LSS mRNA表达，大鼠角膜和晶状体组织中LSS mRNA的相对表达量为0.51±0.04，明显高于角膜组织中的0.29±0.02，差异有统计学意义（t＝－8.34，P〈0.01）。免疫荧光化学法结果表明，LSS主要表达于角膜上皮、基质和内皮层角膜细胞的细胞质以及晶状体上皮细胞和浅皮质层细胞，而视网膜组织中未检测到LSS表达，且视网膜中LSS与NeuN标记的神经元及谷氨酰胺合成酶（GS）标记的Müller细胞无共表达。LC-MS检测显示，正常大鼠视网膜中未检测到羊毛甾醇，大鼠晶状体中含羊毛甾醇为（24.37±2.91）ng/mg，明显高于角膜组织中的（5.31±0.58）ng/mg，差异有统计学意义（t＝－11.13，P〈0.01）。结论 LSS及羊毛甾醇分布于大鼠角膜各层组织以及晶状体组织中，在视网膜各层组织中均无LSS表达。

核素掺入研究氟康唑对真菌麦角甾醇生物合成的影响

目的 :用核素掺入结合放射自显影和液体闪烁计数方法 ,研究抗真菌药物氟康唑对真菌麦角甾醇生物合成的影响。方法 :取新鲜培养的新生隐球菌标准株分别与不同浓度氟康唑预培养 1 0 min后 ,加 [1 - 1 4C]乙酸钠振荡培养 3h,经皂化、提取、薄层展开 ,使角鲨烯、羊毛甾醇和麦角甾醇等分离后 ,用液体闪烁计数法测定上述各成分中 1 4C的掺入量 ,并计算药物对真菌麦角甾醇生物合成的半数抑制浓度 (IC50 )。结果 :在空白对照组中 ,1 4C主要掺入麦角甾醇 ,而经氟康唑作用后 ,真菌的麦角甾醇生物合成受阻 ,1 4C在麦角甾醇中的掺入减少 ,但在羊毛甾醇及其上游成分角鲨烯环氧化物中的积累增多 ,其含量变化均呈剂量依赖性。氟康唑对真菌麦角甾醇生物合成的 IC50 为 32 .1 7nmol/L。结论 :核素掺入法能定量考察羊毛甾醇 1 4 α-去甲基化酶抑制剂氟康唑对羊毛甾醇去甲基化反应的抑制作用 。

新型1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物的合成及抗真菌活性研究

目的：设计合成新型四氢异喹啉类抗真菌化合物。方法：以3，4，5-三甲氧基苯乙胺为起始原料，经Pictet—Spengler反应、中和反应、取代反应、酸性裂解等反应合成目标化合物，并进行体外抗真菌活性研究。结果：设计合成了12个新型四氢异喹啉类化合物，12个目标化合物均为首次报道。所有目标化合物均有抗真菌活性，其中化合物6～8、10～12对4种测试菌的抗菌活性均强于或相当于氟康唑。结论：设计合成的目标分子是一类新型的抗真菌化合物。此类化合物具有进一步研究开发的价值。

基于真菌14α-去甲基化酶的非氮唑类抗真菌先导化合物的设计、合成及其体外抗真菌活性研究

基于真菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)活性位点的三维结构设计并合成了新型四氢异喹啉类抗真菌先导化合物.体外抗真菌活性研究显示:设计的先导化合物具有较好的抗真菌活性.其中化合物5f和5g对于5种测试菌的抗真菌活性强于或相当于对照药物氟康唑.先导分子通过与靶酶活性腔氨基酸残基的非共价键结合产生抗真菌作用,避免与血红素辅基Fe原子发生配位结合,为一类具有新作用机理的非氮唑类抗真菌先导化合物.本研究为抗真菌药物研究提供了新的结合方式及结构类型.

新型四氢萘类化合物合成及体外抗真菌活性研究

根据真菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶的三维结构模型设计、合成了48个新型四氢萘类化合物,所有化合物的结构经过IR,1H NMR和MS确证.体外抗真菌活性研究表明所有化合物对7种临床致病真菌都有抗真菌活性,特别是化合物18,21,22,24的抗真菌活性最强.对接研究显示设计的先导化合物与靶酶活性腔中氨基酸功能残基结合,作用模式不同于氮唑类化合物.结果表明新型四氢萘类化合物是一类全新结构类型的抗真菌化合物.

2-甲基-2-取代-7-羟基-2,3-二氢-4H-1-苯骈吡喃-4-酮及其

目的:对自行设计的抗真菌先导化合物进行衍生物合成和抗真菌活性研究,以验证设计思想,检验模建结果的可靠性。方法:设计合成18个化合物,所有目标化合物经元素分析、1HNMR谱和红外光谱确证,部分化合物还进一步用13CNMR谱、MSEI谱和高分辨质谱确证。用8种人类致病真菌对所有目标化合物测试体外最小抑菌浓度值。结果:合成的18个化合物中,14个(JS1b～d,JS2a～d,JS3a～b,JS4a～d和JS5c)为新化合物。结论:对所合成的化合物进行抗真菌活性测试,结果表明设计合成的衍生物的抗真菌活性变化规律与设计思想吻合,从配体角度验证了模建的靶酶三维结构的可靠性,检测了活性位点力场的分布。

酵母菌Y12667 ERG11基因删除及验证研究

采用同源重组的方法删除酵母菌Y12667内源ERG11基因,并用PCR、Western、细胞计数和GC-MS的方法分别在基因水平、蛋白水平、细胞水平和功能代谢水平进行验证.结果表明,本研究成功删除了酵母菌Y12667内源ERG11基因,该基因删除菌能稳定表达外源性白念珠菌ERG11基因的同源蛋白.因此,该基因删除菌可作为下一步靶酶蛋白功能研究的基因工程表达操作菌.

唑类耐药白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶基因的研究

目的探讨白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)基因突变与对唑类抗真菌药物耐药的关系,从分子水平了解其耐药机制。方法纸片扩散法和NCCL公布的M-27方案测定耐药株对氟康唑和伊曲康唑的MIC;设计引物,PCR扩增唑类耐药白色念珠菌的CYP51基因;扩增产物测序并与Genbank序列相比较分析。结果扩增产物测序分析表明,成功扩增到白色念珠菌CYP51基因。与X13296株序列相比较,两个耐药株都存在有意义突变和无意义突变。两株菌共有22个碱基突变。与以往报道的相同,突变发生氨基酸替换的有F105L、K128T、Y133H、T199I、R267H、G464S和G467K。其中,两株菌都有Y132H和G467K突变。F71L、W244R、T311N和T352I为新发现的突变,未见报道。同时,也发现了9个未发生氨基酸替换的突变。结论白色念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药与CYP51基因突变有关,且为多位点突变。

4种三萜类化合物的微生物转化探讨

目的:对羊毛甾醇、桦褐孔菌醇、齐墩果酸和甘草次酸进行微生物转化研究。方法:采用液体土豆培养基对18种菌株进行振荡培养,对羊毛甾醇、桦褐孔菌醇、齐墩果酸和甘草次酸进行生物转化试验,发酵液用乙酸乙酯或正丁醇萃取并浓缩,萃取液采用薄层色谱鉴定转化结果。结果:黑曲霉3.795转化桦褐孔菌醇的发酵液中出现转化斑点;短刺小克银汉霉AS 3.970、雅致小克银汉霉AS 3.1207、多型孢毛霉AS 3.3443、总状共头霉AS 3.264、刺囊毛霉AS 3.2450等5种菌株转化齐墩果酸的发酵液中出现转化斑点;黑曲霉3.795、短刺小克银汉霉AS 3.970、雅致小克银汉霉AS 3.1207、多型孢毛霉AS 3.3443、侧孢霉AS 3.2882、总状共头霉AS 3.264、细孢毛霉AS 3.2450、黑曲霉AS 3.1858等8种菌株转化甘草次酸的发酵液中出现转化斑点。结论:黑曲霉3.795可用生物转化桦褐孔菌醇,AS 3.970、AS 3.1207、AS 3.3443、AS 3.264、AS 3.2450可转化齐墩果酸,黑曲霉3.795及AS 3.970、AS 3.1207、AS 3.3443、AS 3.2882、AS 3.264、AS 3.2450可转化甘草次酸,所筛菌种均不能转化羊毛甾醇。