Lasiodiplodia theobromae激活芒果防御酶基因差异表达的研究

【目的】为明确Lasiodiplodia theobromae侵染芒果组织的过程中对防御酶相关基因的诱导表达情况。【方法】本研究采用实时荧光定量PCR技术(qRT PCR)研究了Lasiodiplodia theobromae侵染芒果叶片和成熟果实时Mi POD、Mi PPO、Mi CHI、Mi PR1等7个防御酶基因表达情况。【结果】Lasiodiplodia theobromae侵染芒果果实后均不同程度的激活芒果抗病防御酶的活性,抗病防御酶相关基因的表达量极显著,均在被侵染36 h后达最大值,基因Mi POD表达量最高为0 h的33倍,Mi PAL为0 h的450倍;侵染叶片后,活性氧相关基因表达量极显著,均在被侵染24 h后达最大值,抗病相关基因中Mi POD和Mi PPO的表达量呈先上升后下降趋势,基因Mi CHI持续高表达,48 h时表达量达到最大值约为0 h的40倍,Mi PR1在接种72 h时出现最高表达量。【结论】研究表明,寄主植物感病后,Mi POD、Mi PPO、Mi CHI、Mi PR1等7个防御酶基因活性增强,增加寄主植物对病原菌的抵抗能力,进而延缓了病原菌在寄主组织内的迅速扩展。

2株促进沉香形成的色二孢(Lasiodiplodia theobromae)的生物学特性研究

从白木香树中分离了2株色二孢(Lasiodiplodia theobromae)菌株B1和B2;人工接种试验证实它们能促进沉香的形成。本研究结果表明:色二孢菌株B1和B2菌丝生长的最适温度均为30℃;B1的最适培养基是PDA,B2的最适培养基是CA;B1、B2菌丝生长的最适p H值分别是7和8,最适碳源均为可溶性淀粉,最适氮源均为硝酸钠。

静态和振荡条件下产茉莉酸 Lasiodiplodia iranensis 的代谢差异

茉莉酸是一种植物内源激素,在抵抗生物胁迫和非生物胁迫过程中发挥重要作用。该研究以产茉莉酸的伊朗毛色二孢菌CCTCC M2017288为研究对象,比较静态与振荡培养环境下菌株发酵产茉莉酸的参数变化,并利用非靶向代谢组学进行差异分析。结果表明在振荡培养条件下,菌体的生物量大、耗糖速率快但产茉莉酸水平低;同时2种发酵过程中发酵液pH变化、菌体外观形态也不同。通过代谢组学分析,共鉴定出77个差异代谢物;静态与振荡培养比较,差异代谢物下调数量最多的代谢途径是氨基酸代谢;脂质代谢中差异代谢物数量仅有2个,其中茉莉酸上调显著。振荡条件下,菌体摄取的营养物质更多地流向氨基酸代谢和核苷酸代谢,而流向茉莉酸合成的通量相对减少,这在一定程度上解释了振荡条件下茉莉酸产量低的原因,也为认识真菌合成茉莉酸的机制提供了参考。

福建黄果西番莲果腐病菌分离鉴定及其生物学特性

为探究引起福建黄果西番莲采后果腐病的病原菌及其生物学特性,组织分离病果病原菌,采用柯赫氏法验证其致病性,观察病菌形态特征,结合分子生物学鉴定,采用同源性分析与系统发育树构建鉴定病原菌,并初步研究不同温度、pH值、碳源、氮源等对病原菌菌落生长的影响。结果表明,根据形态学和分子生物学鉴定,引起福建黄果西番莲采后果腐病的病原菌为可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae,28℃、pH值6、葡萄糖、硝酸钾分别是L.theobromae菌落生长最适温度、pH值、碳源和氮源。

茶树病害病原菌Lasiodiplodia theobromae生物学特性研究

采用皿内测定方法对贵州省惠水县茶树叶斑病的病原菌Lasiodiplodia theobromae进行了病原生物特性研究。结果表明,其病原菌可在SM、PDA、OA和MEA培养基上生长,菌株在MEA培养基上的生长速率显著快于SM培养基、PDA培养基和OA培养基。病原菌适宜在OA培养基上产孢。碳素和氮素营养可影响菌株的生长及菌丝色素的形成。在PDA培养基上,菌株在33℃条件下的生长速度最快,可适应酸性和碱性条件。但在弱碱条件下生长最为迅速。菌株可在PDB培养基中生长,接种菌碟后生长88 h进入稳定期。

鳄梨蒂腐病毛色二孢属真菌对6种杀菌剂的敏感性

由毛色二孢属(Lasiodiplodia spp.)真菌引起的蒂腐病是对采后鳄梨最具破坏性的病害。为明确鳄梨蒂腐病原群体对杀菌剂的敏感性及6种不同类型杀菌剂在鳄梨蒂腐病防治中的应用潜力,采用菌丝生长速率法测定了来自海南和云南省鳄梨种植区的101个蒂腐病菌菌株对6种内吸性杀菌剂的敏感性,以优势种L. pseudotheobromae建立该种群的敏感性基线。结果表明:多菌灵、甲基硫菌灵、咪鲜胺和苯醚甲环唑对蒂腐病菌菌丝生长均表现出强烈的抑制活性,其平均EC_(50)值分别为(0.06±0.04)、(0.72±0.49)、(0.86±0.98)和(1.25±1.38)μg/mL。其中优势种L. pseudotheobromae对上述4种杀菌剂的敏感性均呈连续单峰曲线,符合正态分布,可将相应的平均EC_(50)值作为鳄梨蒂腐病菌对上述4种杀菌剂的敏感性基线。分别有4%和8%的菌株其咪鲜胺和苯醚甲环唑的平均EC_(50)值大于5μg/mL;91%和100%的菌株对吡唑醚菌酯和嘧菌酯敏感性很低,平均EC_(50)值分别高达(371.03±353.38)和(622.86±771.28)μg/mL,且为非正态分布。同时,针对上述可能已产生抗药性的菌株的靶标基因进行了测序和表达量分析,qRT-PCR结果表明:供试菌株中咪鲜胺和苯醚甲环唑的靶标基因CYP51未发生任何点突变,但经药剂处理12 h后,抗性菌株CYP51基因表达量较敏感菌株显著上调,推测该基因的过表达与病原菌对咪鲜胺和苯醚甲环唑的抗药性形成有关;然而,抗性菌株吡唑醚菌酯和嘧菌酯的靶标基因Cyt b却既没有发生点突变也没有呈现过表达,因此其抗药性形成机制还有待进一步探究。研究表明,我国鳄梨蒂腐病菌对多菌灵和甲基硫菌灵非常敏感,2种杀菌剂可考虑作为鳄梨蒂腐病防治的优先候选药剂,但该病原菌对另外2种供试杀菌剂的潜在抗性也不容忽视。

ε-聚赖氨酸对西番莲果实采后病害与抗病物质代谢的影响

为研究ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)抑制可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)侵染所致黄金西番莲果实采后病害的发生及其与果实采后抗病性的关系,以‘福建百香果3号’黄金西番莲果实为研究对象,以无菌水浸泡处理10 min后接种L. theobromae的西番莲果实为对照组,以100 mg/L ε-PL溶液浸泡处理10 min后接种L. theobromae的西番莲果实为处理组,在(28±1)℃、90%相对湿度下贮藏7 d,每天取样测定果实病斑直径、果皮细胞膜透性、木质素含量和抗病相关酶活性等的变化。结果表明,与接种L. theobromae的西番莲果实对比,ε-PL可延缓果皮细胞膜透性与果实病斑直径的上升。此外,ε-PL还能提高接种L. theobromae西番莲果实的果皮木质素含量,提高果实果皮肉桂酸-4-羟化酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、β-1,3-葡聚糖酶、4-香豆酰辅酶A连接酶、几丁质酶、肉桂醇脱氢酶等抗病相关酶活性。因此,ε-PL通过减缓西番莲果实果皮细胞膜透性的上升而保持果皮细胞膜的完整性,还能提高西番莲果实果皮抗病相关酶活性及促进木质素累积,进而提升果实采后抗病性,抑制L. theobromae侵染所致采后病害的发生。

Diversity of Botryosphaeriaceae species associated with grapevine and other woody hosts in Italy,Algeria and Tunisia,with descriptions of Lasiodiplodia exigua and Lasiodiplodia mediterranea sp.nov

The diversity of Botryosphaeriaceae species associated with“Botryosphaeria dieback”of grapevine was investigated in 18 vineyards in Sardinia,Italy.Lasiodiplodia isolates obtained from different woody hosts including holm oak,sweet orange and broom bush in Italy,Algeria and Tunisia were also characterized.Morphological and cultural characteristics as well as ITS and EF1-αsequence data were used to identify the fungal isolates.Forty-eight botryosphaeriaceous isolates were obtained from 113 symptomatic grapevine samples,from which ten species were identified.Diplodia seriata was the dominant species(25%of isolates),followed by Neofusicoccum parvum(21.7%).Two species,Diplodia olivarum and D.africana are reported for the first time on grapevine.In addition,two new species namely Lasiodiplodia mediterranea sp.nov.from grapevine,holm oak and sweet orange and Lasiodiplodia exigua sp.nov.from broom bush are described.In artificial inoculation experiments conducted on excised green grapevine shoots and lignified canes as well as holm oak seedlings,L.mediterranea was shown to be an aggressive pathogen.

矮龙船花枯梢病病原菌Lasiodiplodia hormozganensis的鉴定

矮龙船花(Ixora williamsii Sandwith)又称小叶龙船花,茜草科龙船花属,常绿灌木或小乔木,是我国亚热带重要的优良绿化树种[1,2],因其花姿优美、花色丰富、花期长而备受人们喜爱。2019年5月,调查发现海南省三沙市矮龙船花病害发生普遍,主要表现为新梢枯萎,严重时导致整株死亡。为了明确引起该病害的病原菌种类,本研究对矮龙船花枯梢病进行了病原菌的分离、致病性测定、形态学观察及分子生物学鉴定,以期为矮龙船花枯梢病有效防治提供参考依据。

北京葡萄溃疡病病原菌Lasiodiplodia citricola的鉴定和生物学特性初探

葡萄溃疡病是由葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)真菌引起的,易造成葡萄果梗干枯、果实干缩或掉粒,枝条或枝干顶梢枯死或表面出现溃疡斑,维管束组织可见褐或黑色的不规则坏死斑,进而影响树势,严重时整株干枯死亡^([1-2])。2020年的田间病害调查发现,北京密云区两个葡萄园内葡萄溃疡病发病比往年严重,发病率均超15%,其中某一采样点病株茎表皮肿大开裂(图1-A),整株干枯死亡率为12%,这与之前溃疡病的典型症状不同。

可可毛色二孢菌F6胞外多糖在草莓保鲜中的应用

目的 探究可可毛色二孢菌F6胞外多糖在草莓保鲜中的作用。方法 采用形态学和分子生物学对从赣南野生松木上分离得到的产胞外多糖真菌F6进行鉴定;从碳、氮源及培养基初始pH方面优化F6菌生长和产多糖发酵条件;用F6胞外多糖浸泡草莓,测量草莓的失重率、腐烂率、有机酸、维生素C含量及感官品质。结果 经形态学与分子生物学鉴定,F6为葡萄糖座科可可毛色二孢属(Lasiodiplodia theobromae);F6产多糖发酵的碳源为蔗糖,不加氮源,初始pH为6;浸泡F6胞外多糖溶液能有效的保持草莓的风味、减少失重、减少腐烂、减缓维生素C含量降低及有机酸降解,多糖浓度6%时效果最佳。结论 F6产胞外多糖发酵成本低,胞外多糖可离心分离,浸泡草莓具有很好的保鲜效果,这为F6胞外多糖在果蔬保鲜及工业应用奠定了良好基础。

防治葡萄溃疡病的杀菌剂筛选与评价

采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了7种杀菌剂对可可毛色二孢CSS-01s的室内生物活性,筛选出3种抑制效果较好的杀菌剂;通过对离体葡萄绿枝条及盆栽葡萄幼苗新梢进行人工接种病原菌,进一步评价杀菌剂的防治效果。结果表明,7种杀菌剂对可可毛色二孢菌丝生长和孢子萌发表现出不同的抑制活性,其中戊唑醇、氯氟醚菌唑、啶酰菌胺和氟啶胺对菌丝生长的抑制作用较强,EC_(50)分别为0.116、0.137、0.109μg/mL和0.119μg/mL;戊唑醇、氯氟醚菌唑、氟啶胺对孢子萌发的抑制作用较强,EC_(50)分别为0.420、0.595μg/mL和1.885μg/mL。CSS-01s接种离体葡萄绿枝条试验中,戊唑醇100、200 mg/L,氯氟醚菌唑100、300 mg/L和氟啶胺100、200 mg/L的防治效果无显著差异,在57.81%~65.31%;CSS-01s接种葡萄幼苗新梢试验中,氟啶胺200 mg/L的防治效果最好,为77.56%,与氟啶胺100 mg/L、氯氟醚菌唑100、300 mg/L和戊唑醇200 mg/L之间无显著差异,但显著高于戊唑醇100 mg/L。研究结果显示,氯氟醚菌唑、戊唑醇和氟啶胺可以作为推荐杀菌剂,经进一步的田间药效评价用于葡萄溃疡病的防治。

‘爱媛38’果腐病致病菌鉴定及其杀菌剂的筛选

对‘爱媛38’杂柑果腐病病果进行组织分离、纯化,得到果腐病致病菌株AY–11和GP–1,运用形态学和分子生物学(ITS、LSU、TUB和EF–α)方法对菌株进行鉴定,确定AY–11和GP–1分别为假可可毛色二孢(Lasiodiplodia pseudotheobromae)和可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae);将菌株回接到健康柑橘果实可致其发病,从发病组织再次分离得到L.pseudotheobromae和L.theobromae,确定AY–11和GP–1是主要致病菌。致病菌对‘意大利酸橙’‘摩洛哥酸橙’‘爱媛38’‘春见’‘枸头橙’均有较强致病性,在枝、叶、果上形成褐色水渍状圆形病斑,其中春见的病斑最大。运用菌丝生长速率法对21种药剂进行室内筛选,结果对AY–11菌丝抑制作用最强的为40%多菌灵可湿性粉剂,EC50值为0.025μg/mL;对GP–1菌丝抑制作用最强的为29%吡萘·嘧菌酯悬浮剂,EC50值为0.023μg/m L。田间药剂防控试验结果显示,45%咪鲜胺水乳剂1000倍液、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂5000倍液、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂800倍液、25%吡唑醚菌酯乳油1000倍液处理的防效达100%,这些杀菌剂用于田间均能减少烂果率,有效防控‘爱媛38’果腐病。

樟树溃疡病菌糖苷水解酶基因LtGH88的克隆与表达

【目的】可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)是樟树溃疡病的主要致病菌。糖苷水解酶是病原菌与寄主植物互作过程中的关键因子。对可可毛色二孢糖苷水解酶基因LtGH88进行克隆与表达分析,为研究LtGH88在樟树溃疡病菌致病机制中的作用奠定基础。【方法】采用PCR方法从可可毛色二孢侵染樟树枝干组织中获得LtGH88基因的CDS序列,运用生物信息学方法分析预测编码蛋白的特征和功能,通过qRT-PCR测定LtGH88在可可毛色二孢侵染樟树过程中的表达量;再利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术初步分析LtGH88基因的功能。【结果】LtGH88基因编码序列长度为1152 bp。其编码蛋白相对分子质量约为42.8 kDa,等电点(pI)为4.56,二级结构由49.09%的α螺旋、11.23%的延伸链和34.99%的无规则卷曲组成。蛋白N端包含18个氨基酸组成的信号肽,属于糖苷水解酶88(GH88)家族,能酶解果胶物质。LtGH88基因在樟树溃疡病菌侵染早期显著表达,不引起本氏烟叶片细胞坏死,且可抑制Bax引发的烟草叶片过敏性坏死反应。【结论】糖苷水解酶LtGH88可能通过抑制寄主免疫反应促进溃疡病菌可可毛色二孢在樟树枝干中的侵入和定殖。

百香果茎基腐病防治药剂筛选及田间盆栽防治效果试验

[目的]为筛选防治百香果可可毛色二孢茎基腐病高效杀菌剂,为有效防治百香果茎基腐病提供科学依据。[方法]采用菌丝生长速率法测定18种常见杀菌剂对病原菌的抑菌效果,并对抑制率100%的杀菌剂进行室内毒力测定,选毒力作用强的杀菌剂进行田间盆栽防治试验。[结果]药剂筛选结果发现500 mg/L的68%精甲霜·锰锌、70%甲基硫菌灵、80%代森锰锌、75%肟菌·戊唑醇、25%丙环唑、50%多菌灵、62.5 g/L精甲·咯菌腈、40%腈菌唑、80%乙蒜素等9种杀菌剂对百香果茎基腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)菌丝体抑制率均达100%;毒力测定结果表明:毒力作用较强杀菌剂依次为50%多菌灵、62.5 g/L精甲·咯菌腈、80%乙蒜素、75%肟菌·戊唑醇,其EC50分别为0.700μg/mL、1.012μg/mL、1.346μg/mL、1.932μg/mL;田间盆栽结果表明:50%多菌灵保护效果最佳,防治效果为76.32%,肟菌·戊唑醇和多菌灵治疗效果最佳,治疗效果分别为69.62%和66.51%。[结论]生产上可用多菌灵预防百香果可可毛色二孢茎基腐病;发病后尽快使用肟菌·戊唑醇、多菌灵进行治疗。

可可毛色二孢AM2As全基因组分泌蛋白预测及功能分析

【目的】对可可毛色二孢AM2As全基因组编码分泌蛋白进行预测及功能分析,为挖掘该病原菌关键致病基因及可可抗病基因提供理论参考。【方法】根据NCBI数据库已公布的可可毛色二孢全基因组序列,利用SignalP 5.0、ProtComp 9.0、TMHMM 2.0、GPI-SOM、LiPop 1.0等生物信息学软件对其分泌蛋白序列进行预测筛选及功能分析,并依据分泌蛋白序列的相似性,应用PHI1 COG和eggNOG-mapper 5.0数据库进行功能注释分析,再利用MEGA X、GSDS 2.0、TBtools 1.09等软件对分泌蛋白组进行系统发育进化及其基因结构和启动子顺式作用元件分析。【结果】可可毛色二孢全基因组共编码13054个蛋白,有638个蛋白具有潜在典型分泌蛋白特征,占总数4.89%。638个分泌蛋白的氨基酸数量为55~1777个,其中以100~400个氨基酸居多,占分泌蛋白序列总数的53.76%,说明大多数分泌蛋白属于小型蛋白。20种氨基酸数量和占比在638个分泌蛋白中存在明显差异,Ala占比最高,其余氨基酸种类占比均未超过10.00%。638个分泌蛋白的信号肽氨基酸数量为15~38个,其中有409个分泌蛋白的信号肽氨基酸数量为17~20个;以非极性氨基酸Ala占比最高,而有带电侧链的Asp和Glu占比最低。信号肽-3和-1位上氨基酸相对保守,切割位点属于A-X-A类型,可被Sp I型信号肽酶识别并切割。将638个分泌蛋白分为七大类群,不同类群成员在蛋白结构、功能和保守基序上呈明显差异。400个分泌蛋白获得功能注释,主要涉及碳水化合物运输和代谢过程、蛋白翻译后修饰及氨基酸代谢和运输过程。分泌蛋白组中共预测出221个CAZymes和244个效应蛋白,其中48个效应蛋白可通过PHI数据库得到功能注释。【结论】可可毛色二孢分泌蛋白功能主要集中在碳水化合物的运输和代谢、翻译后修饰及氨基酸代谢和运输等过程,还有其他未知功能和致病功能,初步推断可可毛色二孢AM2As在侵染致病过程中,受脱落酸反应、生长素反应、低温厌氧反应和光反应等顺式作用元件调控,通过分泌大量碳水化合物降解、代谢、转运等相关蛋白,建立寄生关系,再利用代谢产物帮助自身加速侵染,达到致病的作用。

老枞根际放线菌鉴定及其对可可毛色二孢抑制效果研究

【目的】从老枞根际土壤分离可培养放线菌,获取潜在新物种,并筛选可可毛色二孢菌拮抗菌株。【方法】采用土壤稀释涂布法和三区划线法进行分离和纯化,获得放线菌菌株;通过比对16S rRNA基因序列和构建系统发育树,对菌株进行初步分类和鉴定;采用平板对峙法进行抑菌活性筛选。【结果】(1)共获得81株不同放线菌菌株,分别隶属于链霉菌Streptomyces(54.32%)、节杆菌Arthrobacter(27.16%)、微杆菌Microbacterium(11.11%)、北里孢菌Kitasatospor(4.94%)和短小杆菌Curtobacterium(2.47%)5个属;(2)与已知模式菌株相比,相似度小于98.65%的潜在新种共有20株;(3)经可可毛色二孢平板对峙试验筛选后,获得7株高抑菌活性链霉菌,其中链霉菌ON316885的抑菌率最高,达到63.92%。【结论】武夷山老枞根际土壤中蕴含着丰富的放线菌资源,具有深度挖掘研究的价值,其中一些链霉菌具有较高的生防应用价值。

蓝变木材基底可可球二孢菌丝复合材料的性能

为了提高易蓝变木材的利用率,利用蓝变菌可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)和蓝变的欧洲赤松(Pinus sylvestris)、橡胶木(Hevea brasiliensis)碎料以及两者混合物制成的基底制备菌丝复合材料,并探讨含水率变化对菌丝复合材料性能的影响。结果表明:培养14 d后,三种基底表面均被菌丝覆盖,颜色显著变黑。增加板坯含水率促进了菌丝复合材料内发生木质素再聚合和美拉德反应,提高了菌丝复合材料的弯曲强度。蓝变欧洲赤松基底、蓝变橡胶木基底以及混合基底菌丝复合材料的弯曲强度分别提高了64%、221%和74%。与蓝变欧洲赤松基底相比,蓝变橡胶木基底更适合可可球二孢菌丝的生长,因此橡胶木基菌丝复合材料的弯曲强度更高,可以达到ANSI A208.1-2016“Particleboard”对轻质刨花板的弯曲强度要求。菌丝表面的疏水蛋白使材料表面接触角增大,疏水性增加,而板坯含水率的提高对材料的疏水性和耐水性有削弱作用。

橡胶木变色菌和霉菌的研究——变色和接种试验

本文对从变色,发霉橡胶木上分离到的22个分离物进行了变色和接种试验。结果表明,22个分离物都能不同程度的引起橡胶木的变色,其中以 Lasiodiplodia theobromae,Dothio-rella major 和 Haplosporella sp.变色最严重。若将它们接种到杨树枝条上,则能形成典型的溃疡斑,并在其上形成子实体。Lasiodiplodia theobromae 的海南分离物接种在杨树枝条上45～55天就能产生大量的分生孢子角。

18种植物提取物对松木蓝变菌可可球二孢的抑制性研究

[目的]揭示植物提取物对松木蓝变菌可可球二孢的抑制特性。[方法]以18种广西常见的植物为研究对象,对其进行抽提操作获得提取物,研究其对松木蓝变菌可可球二孢的抑制性。[结果]18种植物提取物的培养皿抑菌平均直径为4.82 cm,变幅为3.74~8.50 cm,存在显著差别。18种植物提取物的抑菌率存在显著差别,平均抑菌率为11.64%,有15种植物提取物的抑菌率为正值,有3种植物提取物抑菌率为负值,分别是苦楝、排风藤(石油醚部分)、湖北海棠(总黄酮),其中湖北海棠(总黄酮)的抑菌率最差,负值高达52.38%。有6种植物提取物的抑菌率高于20%,分别是飞龙掌血、马尾松、阴香、湖北海棠(银皮苷)、羊耳菊、黄荆。其中飞龙掌血的抑菌率最高,达到31.11%。[结论 ]植物提取物对松木蓝变菌可可球二孢的抑制特性因其直径的差别而存在差异,出现较大差别的正负值特性,应针对不同的适用环境选择适合的植物提取物。