LASS1基因克隆及其在大鼠脑皮层的表达与神经元衰老的相关性初步研究(英文)

长寿保障基因 LAG1 是从酵母中克隆的与酵母寿命相关的基因,随酵母生命衰老而表达发生变化. 对大鼠中同源基因LASS1 进行克隆、测序和序列分析,发现其 mRNA 序列不同于 GenBank 中的预测序列,开放阅读框包含 1 053 碱基对,编码蛋白由 350 个氨基酸组成,内含 Lag1 蛋白家族保守的 Lag1p motif 和 TLC 结构域. 从新生、1 月龄、6 月龄、12 月龄和 24月龄大鼠脑顶叶皮质提取总 RNA,用半定量 RT-PCR 及 RNA 印迹方法对 LASS1 在大鼠脑皮质中的表达随年龄变化情况进行分析. 结果表明,出生后 LASS1 表达量随年龄增加而增高,至 6 月龄达高峰,然后随年龄增加而逐渐下降,至 24 月老龄鼠达最低. 衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)对鼠脑皮层染色发现,神经元阳性染色随年龄增长明显增加. 大鼠 LASS1 基因表达在正常衰老过程中发生变化,为进一步研究该基因的作用奠定了基础.

LASS1基因在鼠脑皮层中的表达研究

目的探讨LASS1基因在大脑衰老中的作用。方法分别从胎鼠、新生鼠、1月龄、3月龄、6月龄、11月龄、18月龄和24月龄鼠大脑皮层组织提取总RNA,RT-PCR扩增获得LASS1的cDNA片段并植入pGEM-T载体,以重组质粒载体为定量标准模板,采用Taqman荧光探针,一步法实时定量RT-PCR检测LASS1mRNA表达,并以肌动蛋白基因(β-actin)和18SrRNA基因作为看家基因。结果在胎鼠至青壮年鼠(1～3个月龄)发育过程中大鼠脑皮层LASS1表达水平呈上调趋势,之后随年龄增长逐渐下降;β-actin表达量在胎鼠及新生鼠明显高于成年鼠和老年鼠;18SrRNA基因表达相对稳定。结论成功建立了大鼠LASS1基因表达的荧光实时定量RT-PCR检测方法;大鼠脑皮层中LASS1基因转录水平随年龄变化呈现相应的规律性,这将为进一步研究该基因在衰老过程中的作用提供实验室依据;同时,作为看家基因用于衰老研究,18SrRNA较β-actin基因更为可靠。

酵母双杂交诱饵蛋白LASS1融合表达质粒的构建及鉴定

目的构建酵母双杂交系统诱饵蛋白大鼠LASS1融合表达质粒,为进一步筛选大鼠脑神经元内与LASS1p相互作用的蛋白奠定基础。方法应用PCR方法获得大鼠LASS1基因2个片段,分别克隆入酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7,转染酵母菌AH109并检测重组质粒的自激活现象及毒性。利用Western印迹检测重组质粒在AH109的表达情况。结果LASS1基因的PCR产物片段大小分别为Flag(111bp)、Slag(109bp);Western印迹结果表明2个重组质粒表达的蛋白均可以与抗c-Myc抗体在22kU处特异性反应;重组质粒转化酵母后无自激活作用。结论重组质粒pGBKT7-Flag、pGBKT7-Slag均能够在AH109内正确表达,可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用。

LASS2/TMSG1过表达抑制人肺癌A549细胞增殖和促进A549细胞凋亡:基于上调神经酰胺和p38 MAPK进而启动级联信号传导通路

目的探究人源性长寿保障基因2/肿瘤转移抑制相关基因1(LASS2/TMSG1)过表达对人肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响并探讨相关机制。方法对课题组先前构建好的人肺癌A549细胞阴性对照组和LASS2/TMSG1基因过表达组进行如下实验:Western blot检测LASS2/TMSG1蛋白表达水平,平板克隆形成实验、CCK-8法、Hoechst/PI双染、流式细胞术检测A549细胞体外增殖能力及凋亡情况。将14只裸鼠随机分为阴性对照组和LASS2/TMSG1基因过表达组,7只/组,分别向对应组别的裸鼠颈背部皮下注射A549细胞阴性对照组和LASS2/TMSG1过表达组细胞悬液,构建裸鼠移植瘤模型,检测LASS2/TMSG1基因过表达对A549细胞体内增殖能力的影响。Western blot检测A549细胞及裸鼠移植瘤中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达水平。ELISA法分析A549细胞上清液及裸鼠移植瘤组织匀浆中神经酰胺和p38 MAPK蛋白含量。结果与阴性对照组相比,LASS2/TMSG1基因过表达组A549细胞LASS2/TMSG1蛋白表达量显著升高(P<0.05),体外增殖能力下降(P<0.05),早期凋亡率上升(P<0.05),移植瘤细胞体内增殖受到抑制(P<0.05),A549细胞及裸鼠移植瘤中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达量均显著升高(P<0.05),A549细胞上清液及裸鼠移植瘤组织匀浆中神经酰胺和p38 MAPK含量显著增加(P<0.05)。结论LASS2/TMSG1基因过表达能显著抑制人肺癌A549细胞的体内、外增殖能力,促进肿瘤细胞早期凋亡,这可能与LASS2/TMSG1基因过表达后上调了神经酰胺及其下游的效应分子p38 MAPK蛋白进而启动级联信号传导通路有关。

LASS2/TMSG-1基因过表达对人肺癌95D细胞体外侵袭迁移能力的影响及其机制

目的分析LASS2/TMSG-1基因过表达对人肺癌95D细胞体外侵袭迁移能力的影响,初步探讨LASS2/TMSG-1基因的作用机制。方法运用脂质体转染法将前期已构建好并冷冻保存的Pc DNA3-TMSG-1质粒通过脂质体转染法瞬时转染入95D细胞(高转移潜能,LASS2/TMSG-1低表达),使外源性LASS2/TMSG-1基因在细胞内过表达即LASS2/TMSG-1过表达组,同时设立转染空白质粒的空白对照组和未转染质粒的阴性对照组。应用体外侵袭及迁移实验检测人肺癌95D细胞侵袭及迁移能力的变化;应用qRT-PCR和Western blot法检测LASS2/TMSG-1 mRNA及蛋白的表达;应用Western blot法检测ATP6L、MMP-2及MMP-9在细胞中的表达水平;应用明胶酶谱法检测肿瘤细胞中MMP-2及MMP-9的活性;使用比色法检测细胞中V-ATPase的活性;使用BCECF H+敏感探针检测细胞外H+浓度的变化。结果 LASS2/TMSG-1过表达组细胞的LASS2/TMSG-1表达水平明显升高,而ATP6L表达水平下降,其V-ATPase活性及细胞外H+浓度降低,与空白对照组和阴性对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05);MMP-2、MMP-9的表达及活性均降低,与其他两组相比差异有统计学意义(P<0.05);并且LASS2/TMSG-1过表达组细胞的体外侵袭及迁移能力明显低于其他两组(P<0.05)。结论 LASS2/TMSG-1可能通过结合ATP6L亚基抑制V-ATPase活性,改变细胞外H+浓度,影响MMP-2、MMP-9的表达及活性,进而改变肿瘤细胞的体外侵袭迁移能力等生物学行为。

肿瘤转移抑制基因LASS2/TMSG1 S248A突变体通过增加ATP6V0C表达促进前列腺癌的侵袭

目的:探讨LASS2/TMSG1及其突变体在前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭中的分子作用机制。方法:构建表达LASS2/TMSG1全长及其4个突变体的pc DNA3真核表达载体,并稳定转染到高转移潜能前列腺癌PC-3M-1E8细胞系中;采用q PCR和Western blot法鉴定稳定转染效果,并分析不同点突变体对LASS2/TMSG1和ATP6V0C表达量的影响;采用生长曲线测定、四甲基偶氮唑蓝(MTT)掺入实验、软琼脂集落形成实验、细胞划痕修复实验、Matrigel穿膜侵袭实验和流式细胞术研究LASS2/TMSG1及其4个点突变体的细胞生物学功能,并通过免疫双重荧光染色分析LASS2/TMSG1不同突变体和ATP6V0C的相互作用情况。结果:q PCR和Western blot检测显示LASS2/TMSG1 S248A组较LASS2/TMSG1野生型组ATP6V0C表达增加了3倍(P<0.05),且免疫双重荧光染色结果显示LASS2/TMSG1 S248A组ATP6V0C表达明显增加;与LASS2/TMSG1野生型组相比,LASS2/TMSG1 S248A组的细胞增殖能力、锚着不依赖生长能力、细胞迁移能力(细胞迁移率从35.3%±3.2%增加到70.3%±3%)和侵袭能力(穿膜细胞数从50.0±3.2增加到203.0±6.5)明显提高(P<0.05),G0/G1期比例增加(从51.0%增加到85.4%,P<0.05),但细胞凋亡率亦明显升高(从7%增加到15.1%,P<0.05)。结论:LASS2/TMSG1第248位丝氨酸突变为丙氨酸后(S248A)能促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,其分子机制可能是LASS2/TMSG S248A使ATP6V0C表达量增加,进而促进前列腺癌的侵袭,提示LASS2/TMSG1蛋白第248位丝氨酸是抑制前列腺癌侵袭的重要功能位点。

不同转移潜能人肺癌细胞系中LASS2/TMSG-1的表达及其意义

目的探讨LASS2/TMSG-1在不同转移潜能人肺癌细胞系中的表达及其意义。方法培养95C细胞(人肺巨细胞癌低转移亚系)和95D细胞(人肺巨细胞癌高转移亚系)。采用MTT增殖实验、Transwell侵袭实验、划痕修复实验检测95C和95D细胞的增殖、侵袭及迁移能力;分别用RT-PCR和Western blot法检测两株细胞中LASS2/TMSG-1 mRNA和LASS2/TMSG-1、MMP-9、MMP-13蛋白的表达水平。结果 MTT增殖实验显示,培养至第2-5天,95D细胞的增殖能力强于95C细胞(P<0.05);95D细胞的侵袭能力显著高于95C细胞(t=-20.62,P<0.05);划痕修复实验证实95D细胞的迁移能力强于95C细胞(t=23.56,P<0.05)。LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白在95C细胞中的表达明显高于95D细胞中的表达,差异具有显著性(P<0.01)。MMP-9及MMP-13蛋白在95C细胞中的表达明显高于在95D细胞中的表达(t=-7.009,-13.042;均P<0.01)。结论 LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白在人肺癌低转移亚系95C中的表达显著高于在高转移亚系95D细胞中的表达。该基因可能参与抑制人肺癌细胞的增殖、侵袭及迁移过程,并且可能通过其下游基因MMP-9、MMP-13发挥重要的作用。

肿瘤转移抑制基因LASS2/TMSG1全长及其截短体对人前列腺癌细胞生物功能的影响

目的构建肿瘤转移抑制基因LASS2/TMSG1全长及其截短体质粒,探讨其对人前列腺癌细胞生长、迁移、侵袭等生物学功能的影响。方法构建LASS2/TMSG1基因全长以及3个截短体的慢病毒质粒(pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro),并将其稳定转染到人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8中,采用Western blot法鉴定稳定转染的效果;然后采用软琼脂集落形成实验、细胞划痕修复试验、Transwell体外侵袭实验等分析LASS2/TMSG1基因全长以及3个截短体对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8生物学功能的影响。结果LASS2/TMSG1蛋白和缺失Homeobox(Hox)结构域的截短蛋白,可以有效抑制PC-3M-1E8细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P均<0.001);缺失TLC结构域的LASS2/TMSG1蛋白则丧失抑制前列腺癌细胞生长的功能。结论LASS2/TMSG1蛋白的TLC结构域是抑制前列腺癌细胞生长的关键功能域。

非小细胞肺癌中LASS2/TMSG1的表达及其临床意义

目的探讨LASS2/TMSG1在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及与临床病理特征、预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测NSCLC和癌旁正常组织中LASS2/TMSG1蛋白的表达,分析其表达与NSCLC临床病理特征的关系,并进行术后随访。结果LASS2/TMSG1蛋白在NSCLC组织中的表达(21/87,24.13%)明显低于正常肺组织(15/25,60.00%)。LASS2/TMSG1在NSCLC组织中的表达与肿瘤分化、淋巴结转移呈负相关(P<0.05),且LASS2/TMSG1阳性患者的总生存期及无瘤生存期均明显高于LASS2/TMSG1阴性患者(P<0.05)。多因素Cox分析显示,LASS2/TMSG1是NSCLC患者的独立预后因素。结论LASS2/TMSG1可能抑制肺癌的发生、分化及转移,有望成为肺癌患者的预后指标之一。

线粒体途径参与LASS2/TMSG1基因诱导人肺癌95C细胞凋亡的机制

目的探讨LASS2/TMSG1对人肺癌95C细胞增殖和凋亡的影响及发病机制。方法采用RT-PCR、Western blot法检测LASS2/TMSG1在人不同转移潜能肺癌细胞系95C(低转移潜能)和95D(高转移潜能)中的表达。应用慢病毒转染法将靶向沉默LASS2/TMSG1基因的LV-CERS2-RNAi(30011-1)转染至95C细胞;流式细胞术及MTT检测肿瘤细胞的体外增殖和凋亡情况;倒置显微镜观察细胞常规培养下的状态,透射电镜观察细胞线粒体超微结构的变化;荧光显微镜结合JC-1染液观察细胞线粒体膜电位的变化;Western blot法检测细胞中LASS2/TMSG1、Akt3、P-Akt3、Bax、BCL-2的表达水平。结果LASS2/TMSG1在95C细胞中的mRNA(t=16.85,P=0.004)及蛋白表达水平(t=15.26,P=0.004)明显高于95D细胞;LASS2/TMSG1沉默后,95C细胞中LASS2/TMSG1 mRNA(F=164.053,P<0.001)和蛋白(F=18.293,P=0.003)的表达明显降低;流式细胞术检测LASS2/TMSG1基因沉默组细胞的凋亡率明显降低(F=17.340,P=0.003);MTT检测显示LASS2/TMSG1沉默组细胞从第4天(F=66.318,P<0.001)、第5天(F=224.582,P<0.001)开始,细胞增殖率明显增高;电镜和荧光显微镜观察发现,LASS2/TMSG1基因沉默,对线粒体膜电位水平的下降有干扰作用(F=14.687,P=0.005);P-Akt3蛋白(F=28.628,P<0.001)及BCL-2蛋白(F=6.049,P=0.036)表达水平升高;Akt3、Bax蛋白表达量无相关性。结论LASS2/TMSG1基因可能抑制V-ATPase活性,使细胞内H+浓度升高,线粒体膜电位降低,线粒体凋亡通路中的相关蛋白释放促进95C细胞凋亡。

LASS2/TMSG-1、TAK1和TAB1在结肠癌中的表达及临床意义

[目的]探讨肿瘤转移抑制基因-1(LASS2/TMSG-1)、转化生长因子激活激酶1(TAK1)和转化生长因子β活化激酶结合蛋白1 (TAB1)在结肠癌组织中的表达及其临床意义。[方法]选取2017年1月至2018年2月在我院治疗的原发性结肠癌患者68例,分别取其结肠癌组织及癌旁正常组织,采用实时聚合酶联法(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)测定组织中的LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1表达水平,分析结肠癌组织中LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1的表达水平以及与患者临床病理特征的相关性,采用COX回归分析分析LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1表达水平与患者预后的相关性。[结果]结肠癌患者结肠癌组织TAK1(0.76±0.15ng/ml)、TAB1(1.46±0.20ng/ml)的表达水平与癌旁正常组织(0.57±0.15ng/ml,1.21±0.19ng/ml)相比显著升高;LASS2/TMSG-1的表达水平(1.52±0.36ng/ml)与癌旁正常组织(2.36±0.43ng/ml)相比显著下降(P<0.05)。LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期显著相关(P<0.05)。术后12个月随访时共有8例(11.76%)患者出现肿瘤复发/转移。出现肿瘤复发/转移的患者其TAK1、TAB1水平(0.96±0.15ng/ml,1.68±0.19ng/ml)与未复发/转移(0.52±0.13ng/ml,1.26±0.20ng/ml)患者相比显著升高;LASS2/TMSG-1显著下降(1.74±0.38ng/ml vs 3.02±0.49ng/ml)(P<0.05)。COX回归分析结果显示,肿瘤分化程度、肿瘤TNM分期、LASS2/TMSG-1、TAK1及TAB1表达水平是影响结肠癌患者临床预后的独立因素。LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1表达水平之间无显著相关性(P>0.05);患者预后与LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1表达水平具有显著相关性(P<0.05)。[结论] LASS2/TMSG-1、TAK1、TAB1的表达水平可能与结肠癌的发生及发展具有相关性,且与患者临床预后相关。

LASS2/TMSG-1基因沉默对人肺癌95C细胞侵袭迁移机制探讨

目的 LASS2/TMSG-1是近年来新发现的一种肿瘤转移抑制基因本实验主要研究沉默LASS2/TMSG-1基因对人肺癌细胞系低转移潜能亚系95C细胞的体外侵袭迁移能力的影响,初步探讨LASS2/TMSG-1基因的作用机制。方法采用蛋白质印迹法检测LASS2/TMSG-1在人不同转移潜能人肺癌细胞系95C(低转移潜能)和95D(高转移潜能)细胞中的表达情况。运用脂质体转染法将靶向沉默LASS2/TMSG-1基因的Psilencer2.1-U6/TMSG-1shRNA转染95C细胞(低转移潜能,LASS2/TMSG-1高表达),实验分为空白对照组(Normal)、无关阴性对照组(Control)及LASS2/TMSG-1基因沉默组(Silence)三组。应用体外侵袭实验、迁移实验检测细胞侵袭与迁移能力的变化;利用蛋白质印迹法检测LASS2/TMSG-1、ATP6L、MMP-2、MMP-9及Bcl-2在细胞中的表达水平及MMP-2的活性;使用比色法检测细胞中V-ATPase的活性;使用BCECF-AM与BCECF氢离子敏感探针检测细胞内外氢离子浓度的变化。结果 LASS2/TMSG-1在95C细胞系中的蛋白表达量(1.09±0.46)明显高于在95D细胞系中的表达(0.53±0.25),差异有统计学意义,z=1.925,P<0.05。转染LASS2/TMSG-1shRNA 48h后,Silence组LASS2/TMSG-1 mRNA表达量为0.76±0.03,Control组为1.56±0.10,Normal组为1.66±0.42,差异有统计学意义,H=10.56,P<0.05;Silence组LASS2/TMSG-1蛋白表达量为0.56±0.09,Control组为1.57±0.08,Normal组为1.66±0.08,差异有统计学意义,H=14.84,P<0.05。质粒瞬时转染48h后,体外侵袭实验显示,Silence组穿膜细胞数为50.67±6.74,Control组为25.33±10.21,Normal组为27.17±6.40,差异有统计学意义,H=11.39,P<0.05;体外迁移实验显示,Silence组穿膜细胞数为98.50±10.70,Control组为26.50±4.87,Normal组为30.25±7.81,差异有统计学意义,H=15.89,P<0.05。与Normal组及Control组相比,沉默组细胞V-ATPase的C亚基ATP6L的mRNA(z=2.31,P<0.05;z=2.46,P<0.05)及蛋白表达(z=2.62,P<0.05;z=2.61,P<0.05)升高,V-ATPase的活性(z=3.13,P<0.05;z=3.14,P<0.05)和细胞外氢离子浓度(P均<0.05)升高,而细胞内氢离子浓度与其他两组相比明显降低(P均<0.05);并且MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白的表达(P均<0.05)及MMP-2的活性升高(P=0.05)。结论 LASS2/TMSG-1是一种肿瘤转移抑制基因,可能参与抑制肺癌侵袭及转移过程。沉默LASS2/TMSG-1基因表达后,V-ATPase质子泵中关键性C亚基(ATP6L)的表达上升,且基因沉默后其V-ATPase活性增强、细胞内H+浓度下降及细胞外H+浓度上升,反向提示LASS2/TMSG-1可以通过结合ATP6L亚基抑制V-ATPase活性,从而改变细胞内外氢离子浓度,进而影响MMP-2、MMP-9的表达及MMP-2的活性,进而改变肿瘤细胞的侵袭迁移能力等生物学行为。该过程中,Bcl-2可能参与诱导了MMP-2及MMP-9的表达。