Lats1基因敲除小鼠卵巢玻璃化冷冻的研究

目的对小鼠卵巢玻璃化冷冻的方法和冷冻液进行研究,摸索出一种简便的小鼠卵巢冻存法。方法用玻璃化冷冻液EFS40对Lats1基因敲除杂合子小鼠卵巢进行玻璃化冷冻,冷冻效果通过解冻后的卵巢肾包膜下易位移植、卵巢囊原位移植和对移植后的成活卵巢进行组织学检查来判定。对出生的后代进行Lats1基因检测,来判定卵巢原位移植结果的可靠性。结果与结论解冻后的卵巢肾包膜下移植733%成活,并具有正常的功能;卵巢囊移植后卵巢存活率为467%,受体怀孕率为333%,平均产仔数为(37±22)只,后代中能检出Lats1基因;试验中还发现,受体的发情时间普遍提前10d左右。

牛LATS1基因启动子转录调控分析

【目的】探究牛大肿瘤抑制基因1(Large tumor suppressor gene1,LATS1)的组织表达规律,并初步鉴定其启动子区关键转录因子,以期阐明其转录调控机制。【方法】利用荧光定量PCR检测LATS1基因在牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪、背最长肌、大肠、小肠、大脑、皱胃及睾丸组织中的相对表达量。克隆牛LATS1基因启动子的全长序列,通过逐段缺失PCR技术扩增7个缺失不同片段的启动子序列,并构建其双荧光素酶报告载体,分别转染小鼠C2C12和3T3-L1细胞系,通过检测不同缺失片段荧光素酶报告载体的活性,确定LATS1启动子核心区域。使用在线软件预测牛LATS1基因启动子核心区域的关键转录因子。【结果】LATS1基因在大脑、背最长肌、大肠、皱胃、肾脏中高表达。克隆了1950 bp的LATS1基因启动子序列及其7个逐段缺失片段序列,并成功构建了pLATS1-1783/+167、pLATS1-1449/+167、pLATS1-1149/+167、pLATS1-837/+167、pLATS1-555/+167、pLATS1-298/+167和pLATS1-123/+167双荧光素报告载体。检测到牛LATS1基因启动子核心区域位于-298/-123区域。在线软件预测到牛LATS1基因启动子核心区存在肌细胞增强因子2(MEF2A)、转录激活因子5(STAT5)、同源异型盒基因5(HOXA5)、肌细胞决定基因1(Myod1)和靶向叉头框转录因子1(FoxO1)结合位点。【结论】克隆了牛LATS1基因启动子,明确了其核心区位于-298/-123区域;MEF2A、STAT5、HOXA5、Myod1和FoxO1可能对牛LATS1基因转录活性具有重要的调控作用。

Lats1基因敲除小鼠保种的研究

目的 以Lats1基因敲除小鼠为例 ,研究国家遗传工程小鼠资源库遗传小鼠的保种技术路线及方法。方法 采用了胚胎移植 ,目的基因检测 ,胚胎冷冻等技术。结果 在库内得到 2 4只Lats+ -小鼠 ,扩群后 ,冷冻保存 110枚胚胎。结论 上述方法能确保Lats1基因敲除小鼠资源库保种成功。

蛭龙活血通瘀胶囊通过Lats1/Yap通路改善脑出血诱导的脑损伤

目的:探究蛭龙活血通瘀胶囊在体外脑出血模型中能否减轻脑出血损伤及其机制。方法:40只健康8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组及蛭龙活血通瘀胶囊低(0.35 g/kg)、中(0.7 g/kg)、高(1.4 g/kg)剂量组,采用Ⅶ型胶原酶以小鼠尾状核为目的注射点制备小鼠脑出血模型,24 h后进行神经功能缺失评分,蛭龙活血通瘀胶囊各组连续灌胃给药3 d。另用巨噬细胞条件性Yap基因敲除小鼠同等建立脑出血模型。通过观察改良神经功能缺失评分(mNSS)评估小鼠神经功能,HE染色分析脑组织病理形态及神经细胞损伤情况,免疫组化、Real Time PCR和Western Blot法检测小鼠出血区周围炎症因子及Lats1/Yap通路的基因与蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组神经功能障碍差异有统计学意义,脑组织病理损伤严重;与模型组比较,蛭龙活血通瘀胶囊组和Yap基因敲除小鼠神经功能障碍明显减轻,脑组织病理损伤减轻,炎症因子及Lats1/Yap通路相关信号分子表达下调。结论:蛭龙活血通瘀胶囊可能通过调控Lats1/Yap信号通路减轻脑出血损伤,发挥脑保护作用。

过表达LATS1抑制头颈部鳞状细胞癌B88细胞增殖和侵袭及其临床意义

目的 :探讨大肿瘤抑制基因1(large tumor supressor gene 1,LATS1)对头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)B88细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,以及其临床意义。方法 :构建LATS1过表达重组质粒并稳定转染至B88细胞中。蛋白质印迹法检测B88细胞中LATS1蛋白的表达水平;分别采用MTT法和Transwell小室法检测LATS1过表达对B88细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;蛋白质印迹法检测细胞中上皮-间质转化相关蛋白β-连环蛋白(β-catenin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、扭曲蛋白(Twist)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9和锌指E-盒结合同源异形盒蛋白2(zincnger E-box-binding homeobox-2,ZEB-2)表达的影响。收集正常头颈部鳞状上皮组织、异型增生组织及HNSCC组织,制成组织芯片,并采用免疫组织化学法检测LATS1蛋白在上述组织中表达的差异。收集临床病理资料,分析LATS1表达与HNSCC患者临床病理参数之间的关系。结果 :重组pCDNA3.1-LATS1转入B88细胞后,B88细胞中LATS1蛋白的表达水平明显升高(P <0.05)。LATS1过表达可明显抑制B88细胞的增殖(P <0.05)和迁移及侵袭能力(P值均<0.05)。蛋白质印迹法检测结果表明,LATS1转染组中β-catenin和E-cadherin蛋白的表达水平明显上调(P值均<0.05),而N-cadherin、Twist、MMP-2及MMP-9蛋白的表达水平明显下调(P值均<0.05)。组织芯片免疫组织化学法检测结果显示,HNSCC组织中LATS1蛋白的表达水平较正常头颈部鳞状上皮组织和异型增生组织明显降低;细胞核中LATS1的表达在正常头颈部鳞状上皮组织、异型增生组织和HNSCC组织中依次下调(P <0.05),而细胞质中LATS1的表达则依次上调(P <0.05)。HNSCC患者临床病理资料后分析发现,在HNSCC组织中细胞质LATS1的阳性表达率与淋巴结转移呈正相关性(P <0.05)。结论 :LATS1可明显抑制HNSCC细胞的增殖、迁移、侵袭及上皮-间质转化。在HNSCC组织中,LATS1可能发生细胞核向细胞质的转位,且细胞质中LATS1的表达与淋巴结转移有关。