LBA4404中的质粒消除与筛选

通过提高生长温度和化学消除剂相结合的方法对菌株LBA4404中的质粒进行消除。将过夜培养的工程农杆菌LBA4404接种于含SDS（0％～0．08％）的新鲜YEB培养基中，于42℃震荡培养72h。当SDS的浓度大于或等于0．06％时，菌体不能生长。SDS的亚致死浓度为0．05％。菌液稀释后涂YEB平板，将所有单菌落分别对应影印到普通YEB平板和抗性平板，检测由质粒编码的str和rif基因是否丢失，质粒的DNA电泳图像证实了LBA4404的衍生株3号、11号中的质粒已完全被消除，25号的质粒带明显变淡。

植物表达质粒pBin438-IFN-γ的构建及向农杆菌LBA4404的高效转化

采用PCR扩增、酶切、连接、转化技术 ,构建了植物表达质粒 pBin4 38 IFN γ .采用PCR法筛选和检定阳性克隆 ,阳性率为 30 % .采用自行设计的热激转化法将重组质粒导入农杆菌LBA4 4 0 4中 ,转化率为 1.2× 10 6 /μgDNA .

用LBA4404/pCAMBIA系列转化水稻的最佳条件

用带有ｇｕｓ报告基因的农杆菌ＬＢＡ４４０４／ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ 转化水稻品种鄂宜１０５ 成熟胚诱导的愈伤组织，以ｇｕｓ基因瞬间表达活性为指标测定转化频率，对于利用ｐＣＡＭＢＩＡ 表达载体系列进行水稻遗传转化的最佳条件进行了初步的研究．结果表明：最适菌液浓度值为Ｄ（６００）＝ １．０；最适共培养温度为２２～２８ ℃；共培养培养基的ｐＨ 值在５．２～６．２ 这一较宽的范围内均可．共培养时间以不超过３ ｄ 为宜；在共培养培养基中加入乙酰丁香酮对提高转化效率非常重要，而在菌液中加入乙酰丁香酮处理对提高转化效率作用不大．但不同品种，甚至不同转化受体之间存在一定的差别，其最佳转化条件应视具体情况在此基础上加以摸索．

转猪轮状病毒VP6基因烟草植物的获得

根据G enB ank中轮状病毒VP 6序列设计1对引物,从pGEM-T-VP 6质粒中扩增VP 6 PCR产物。将VP 6克隆到PB I121质粒中,转化根癌农杆菌LBA 4404,挑取阳性菌落的质粒进行酶切鉴定。用叶盘法转化烟草,获得再生苗,用RT-PCR、PCR和PCR-sou thern杂交方法进行鉴定,结果表明,VP 6基因已成功地转入烟草中。

利用电转化和三亲杂交方法高效转化根癌农杆菌

目的探索根癌农杆菌的高效转化方法。方法考察质粒经电击转化法转化根癌农杆菌 (A grobacteriumtumefaciensLBA440 4)的影响因素 ,并优化其转化条件 ;研究采用三亲杂交方法 ,将带有vgb基因簇的重组质粒 pYG3 0 8导入A .tumefaciensLBA440 4;经PCR扩增反应进行验证。 结果外加电场强度和脉冲时间是决定电转化效率的关键因素 ,两者适当组合才可获得高转化效率 ;采用对数期中期的细菌和提高细菌浓度均可提高转化效率。用三亲杂交方法转化A .tumefaciensLBA440 4,可得到较高的转化效率。所获抗性转化子的质粒DNA酶切图谱正确。结论带有双元载体 (含vgb基因 )

将TERF1基因导入糖橙的研究

用携带TERF1基因的EHA105和LB4404 2种农杆菌分别转化糖橙实生苗节间茎段。根据已建立的再生体系和转化体系,对已得到的抗性芽经PCR和RT-PCR检测,验证已获得7个转TERF1基因的糖橙株系。此外,还比较了2种农杆菌菌株对糖橙的浸染能力,结果表明,EHA105农杆菌的浸染能力强于LB4404。

鹅细小病毒NS1基因植物真核表达载体的构建

根据发表的鹅细小病毒GPV B株全基因组设计一对引物,采用PCR方法扩增出鹅细小病毒扬州株(GPV YZ)非结构蛋白基因NS1,克隆到植物表达载体pBI121中,转化至大肠杆菌感受态细胞JM109。经菌液PCR、双酶切及质粒PCR鉴定后,将阳性重组质粒转化感受态农杆菌LBA4404。经菌液PCR及质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-NS1,该载体的构建为进一步研究鹅细小病毒NS1基因的分子生物学特性打下良好基础。

万寿菊雄性不育两用系遗传转化体系的建立

为了筛选适合万寿菊不定芽诱导的最佳外植体及激素浓度组合,并探讨该组织部位对卡那霉素、潮霉素的抗性临界点以及头孢霉素和利福平对LBA4404的抑菌性效果,构建万寿菊遗传转化体系。本研究以三种激素为组合,以万寿菊雄性不育两用系2-2的子叶、下胚轴、叶片为材料筛选出适合万寿菊的再生体系的激素配比及最佳的组织部位;以万寿菊子叶为材料筛选其对卡那霉素、利福平、头孢霉素、潮霉素四种抗生素抗性临界点;筛选利福平、头孢霉素对农杆菌LBA4404的抑菌浓度。结果表明:1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+30 g蔗糖的MS培养基可以作为万寿菊子叶的最佳诱导激素浓度组合,MS5和MS9可以在万寿菊叶片中诱导出不定芽,但诱导率极低,下胚轴在48个激素组合无不定芽的产生;利福平和头孢霉素两种抗生素浓度在200 mg/L时能对LBA4404农杆菌的生长起到有效的抑制,并且在该浓度下对万寿菊子叶不定芽的产生起到一定的促进作用;子叶对于潮霉素、卡那霉素的抗性浓度分别为30、100 mg/L。利用建立的万寿菊再生体系及抗生素浓度体系可以为农杆菌介导万寿菊遗传转化提供理论基础。

重组根瘤农杆菌葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶性质

目前已发现的葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶均来源于真菌,尚无原核细胞来源的相关报道。从根瘤农杆菌LBA4404中克隆β-葡萄糖苷酶基因bg1,将其构建在表达载体pET-28b上,转化Escherichia coli RP(DE3),IPTG诱导表达。重组β-葡萄糖苷酶的比活高达36.7μmol/(min·mg)。对经过Ni柱纯化的重组酶进行酶学分析发现:该酶是糖基水解酶家族1的成员,底物亲和力高,专一性低,在温度为40℃和pH在5-8之间时具有较高的酶活,在低于40℃和pH5-10之间时可稳定保存。以pNP-β-Glc为底物,该酶的最适pH为6.4,最适温度为60℃,在37℃和pH6.4的反应体系中,该酶的Km为0.09mmol/L,竞争性抑制剂葡萄糖酸-δ-内酯和葡萄糖的Ki分别为0.03mmol/L和75mmol/L,具有很高的葡萄糖耐受性,当金属离子Ag+和Zn2+存在时,酶活被明显抑制。该酶对pNP-β-Gal和pNP-α-Glc的Km分别为3.61mmol/L和14.31mmol/L。