农产品与饲料中T-2毒素免疫亲和柱净化-液相色谱串联质谱检测技术研究

利用T-2毒素单克隆抗体2G7和CNBr活化的Sepharose 4B研制出T-2免疫亲和柱，考察了T-2免疫亲和柱的最佳应用条件。利用免疫亲和柱，建立了农产品与饲料中T-2毒素免疫亲和柱净化/液相色谱-串联质谱（ IAC/LC-MS/MS）确证性检测技术，并考察该方法的准确度和精密度。结果表明，T-2毒素在0.5-500.0 ng/g范围内线性关系良好，相关系数为0.9997，检出限为0.05 ng/g，定量下限为0.17 ng/g。大米、玉米、饲料样品在T-2毒素10，50，100 ng/g的加标水平下，回收率为92.9％-109.7％，相对标准偏差为2.1％-8.3％。对市售36份农产品与饲料样品进行测定，检测结果的相对标准偏差均小于10.0％。

HPLC-MS法测定关附甲素及其在Caco-2细胞上的摄取特性

目的建立关附甲素的LC-MS测定法,研究其在Ca-co-2细胞上的摄取特性。方法采用ShimadzuVP–ODS,C8柱,(250mm×2.1 mm,5μm),流动相:乙腈∶水=30∶70(V/V),用0.2%冰乙酸溶液,加入二乙胺适量调pH至4.0左右,流速:0.2 ml.min-1,电喷雾离子化(ES1)方式,采用选择性离子检测法,检测离子为正离子,关附甲素的选择性离子:[M+H],m/z 430。考察温度、药物浓度、时间和pH值对关附甲素在Caco-2细胞上摄取的影响。结果关附甲素在0.2～50.0μmol.L-1的范围内呈良好的线性关系(r=0.9988),最低定量限0.2μmol.L-1。关附甲素在Caeo-2细胞上的摄取具有一定的浓度、时间和pH值依赖性,其摄取表现为被动扩散。结论该法灵敏、简单,专属性强,关附甲素在Caco-2细胞上具有良好的摄取。

丹参成分在Caco-2细胞中吸收的研究

目的建立改良的Caco-2细胞模型研究丹参中的可吸收成分,并用在体动物模型验证。方法HPLC-MS方法测定加入丹参水提取物的Caco-2细胞破碎液中的丹参成分,并与大鼠在体灌流给药后血浆中的成分相比较。结果加药Caco-2细胞破碎液中检测到丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B7种丹参的成分,给药后大鼠血浆中检测到丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A共8种丹参的成分。结论细胞破碎液中检测的成分为丹参在Caco-2细胞中有吸收的成分,本方法可作为研究中药吸收的新方法。

HPLC/MS^2法检测某些降糖中药制剂中的双胍类及磺酰脲类化学药

目的:建立液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用法测定纯中药降糖药中非法掺入的双胍类及磺酰脲类化学药,包括二甲双胍、苯乙双胍、格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、格列齐特。方法:选用Agilent C_(18)(4.6 mm×150 mm,5μm),以0.02 mol·L^(-1)醋酸铵溶液(醋酸调节pH至3.5)-甲醇-乙腈为流动相,梯度洗脱。根据所检测到化合物的色谱保留时间及一级、二级质谱信息,并与对照品比较,鉴别中药制剂中非法掺人的双胍类、酰脲类化学药。结果:通过相对分子质量、二级质谱碎片信息和液相色谱保留时间三方面信息,与对照品比较,证明样品A中非法掺有苯乙双胍、格列本脲,样品B中掺有二甲双胍、格列本脲。结论:该方法选择性强,灵敏度高,可作为分析检测非法中药制剂的有效手段。

LC-MS测定雷公藤甲素及其在Caco-2细胞上的转运特征

目的:建立体外模拟体内肠道细胞的Caco-2细胞Transwell模型,以此研究雷公藤甲素在Caco-2细胞模型上的跨膜转运特征。方法:采用聚酯碳酸酯膜连续培养Caco-2细胞21天,形成致密的单层细胞模型。然后对影响雷公藤甲素在Caco-2细胞模型上转运特征的因素包括浓度、时间及跨膜转运蛋白(P-糖蛋白,多药耐药蛋白,乳腺癌耐药蛋白)进行考察;同时采用LC-MS对溶液中的雷公藤甲素的含量进行测定。结果:雷公藤甲素主要以主动转运的方式进行吸收,且随着时间和药物浓度的增加,转运量明显增加。结论:雷公藤甲素在Caco-2细胞上转运存在一定的浓度及时间依赖性,且P-gp介导雷公藤甲素在Caco-2细胞上转运。

LC/MS/MS鉴定莲子心生物碱在Caco-2细胞中的代谢产物

目的：应用LC/MS/MS鉴定去甲乌药碱、莲心碱、异莲心碱、荷花碱4种莲子心生物碱在Caco-2细胞中的代谢产物,推测其代谢途径。方法：100μmol/L生物碱作用Caco-2细胞3～12 h后收集并纯化样品,采用LC/MS/MS分析鉴定代谢产物。结果：去甲乌药碱的代谢产物有甲基化去甲乌药碱和去甲乌药碱葡萄糖醛酸苷;莲心碱和异莲心碱的代谢产物分别是去甲基莲心碱和去甲基异莲心碱;荷花碱的主要代谢物为莲心碱、异莲心碱和它们的进一步去甲基产物。结论：LC/MS/MS操作简便,可快速鉴定Caco-2细胞中的莲子心生物碱的代谢产物。莲子心生物碱主要代谢途径有甲基化、去甲基化和葡萄糖醛酸化。

基于质谱技术的黄芩治疗2型糖尿病的粪便代谢组学研究

采用粪便代谢组学方法,运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)技术研究了黄芩治疗2型糖尿病大鼠的作用机制。采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析方法(OPLS-DA)对健康对照组、2型糖尿病模型组和黄芩治疗组的大鼠粪便中内源性代谢物进行分析,寻找黄芩治疗2型糖尿病大鼠的潜在生物标志物。结果表明,健康对照组、2型糖尿病模型组和黄芩治疗组的大鼠粪便代谢图谱有显著的区分;发现并鉴定了11种潜在的生物标志物。黄芩对2型糖尿病大鼠的鞘脂类代谢和脂肪酸代谢具有调节作用;对三羟基三甲基吲哚酮、白三烯E4、亮氨酰脯氨酸和雌二醇的含量具有调节作用;同时,大鼠体重和空腹血糖的变化趋势表明,黄芩具有改善糖尿病症状的作用。

甲基莲心碱对2型糖尿病模型大鼠作用的代谢组学研究

目的研究甲基莲心碱对2型糖尿病模型大鼠尿液的代谢产物的影响。方法高脂高糖饲料喂养联合腹腔注射链尿佐菌素造2型糖尿病大鼠模型,糖尿病造模成功后腹腔注射甲基莲心碱20 mg.kg-1.d-1,4周后测大鼠空腹血糖。收集大鼠24 h尿液,样品经处理后进行UPLC/QTOF-MS分析。结果甲基莲心碱处理组大鼠空腹血糖较糖尿病模型组降低(P<0.05)。甲基莲心碱处理糖尿病大鼠后有4种代谢物的含量发生了明显变化,其中二羟延胡索酸(di-hydroxyfumaric acid)下降,前列腺素I2(prostaglandin I2,PGI2)、脂氧素A4(lipoxin A4,LXA4)、脂氧素B4(lipoxinB4,LXB4)升高。结论甲基莲心碱可降低糖尿病大鼠的血糖,改变糖尿病大鼠尿液的代谢产物,其机制可能与其抗氧化应激、抗炎等作用有关。

液相色谱串联质谱法测定辐照含脂食品中2-十二烷基环丁酮的研究

以辐照含脂食品为实验材料,首次建立了液相色谱串联质谱法(HPLC-ESI-MS/MS)测定辐照含脂食品中2-十二烷基环丁酮(2-DCB)的含量。样品经正己烷提取浓缩得到脂肪,再经中性氧化铝柱净化后,采用液相色谱串联质谱法(HPLC-ESI-MS/MS)分析,多反应监测模式下(MRM)外标法定量。结果表明:方法在5～100μg/L范围内线性良好,线性相关系数为r=0.9996,定量下限为0.08 mg/kg(以脂肪计),回收率在75%～95%之间,相对标准偏差(RSD)小于10%。该方法前处理过程简便快捷,回收率高,可满足实验室大量、快速分析的需求。

稳定同位素示踪法用于Caco-2细胞葡萄糖吸收模型的研究

目的建立Caco-2细胞葡萄糖吸收模型,为考察药物对葡萄糖吸收的影响提供方法。方法 Caco-2细胞培养7,14,21 d后,分别加入25,50,75,100 mmol.L-1的葡萄糖溶液孵育5,10,15,20 min,采用高效液相色谱-质谱联用技术,以稳定同位素示踪法比较培养时间、葡萄糖浓度以及孵育时间对葡萄糖吸收的影响。结果 Caco-2细胞培养21 d后葡萄糖的吸收优于培养7 d和14 d的吸收,吸收量大,趋势稳定。此时用75 mmol.L-1的葡萄糖溶液孵育细胞10 min,葡萄糖吸收量与100 mmol.L-1比较差异无统计学意义,但高于25,50 mmol.L-1时的葡萄糖吸收量。结论本实验条件下建立的Caco-2细胞模型可作为研究葡萄糖吸收的模型。

2-甲氧基-4-吗啉基重氮苯氯化锌盐的结构鉴定

通过红外光谱(IR)、能谱(EDS)、液质联用(LC-MS)以及核磁共振(NMR)等现代仪器分析技术,对一种黄色未知物进行结构鉴定,确认未知物的结构为2-甲氧基-4-吗啉基重氮苯氯化锌盐。

一种常用免疫分析系统对25(OH)D_(3)和25(OH)D_(2)回收率的评价研究

目的以液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)为参考方法,评价临床常用的索灵(DiaSorin)全自动免疫分析系统对25-羟基维生素D_(3)[25(OH)D_(3)]和25-羟基维生素D_(2)[25(OH)D_(2)]的回收率是否满足临床检测的要求。方法参考实验室定值的DEQAS 5个水平质控品,用以评价索灵检测25(OH)D的准确度。索灵自带高低值质控品每日4次重复测试,连续5d检测用以评价索灵检测高低值25(OH)D的精密度。解放军总医院健康查体剩余血清样本810例,分别由索灵及LC-MS/MS检测25(OH)D。Passing-Bablok回归、组内相关系数(intraclass correlation coefficient,ICC)分析两种检验方法的相关性和一致性。所有样本根据25(OH)D_(3)及25(OH)D_(2)占总25(OH)D的百分含量由低到高分别分组,计算各组检测偏差,分析索灵检测偏差随25(OH)D_(3)、25(OH)D_(2)百分含量增加的变化趋势。结果索灵免疫法检测25(OH)D的精密度较好(CV<10%),检测结果与LC-MS/MS相比相关性和一致性均较好,但仍然存在一定的检测偏差。810例样本平均检测偏差为-4.65ng/mL(-16.55%)。索灵检测偏差与25(OH)D_(3)或25(OH)D_(2)百分含量不具有线性相关关系;25(OH)D_(3)或25(OH)D_(2)百分含量的增加不增加索灵的检测偏差。结论索灵全自动免疫分析系统检测维生素D与LC-MS/MS一致性较好,该免疫法对25(OH)D_(3)和25(OH)D_(2)回收率满足临床检测的要求。

LC/MS/MS鉴定千金子二萜类化合物在Caco-2细胞中的代谢产物

目的:研究千金子素L1、千金子素L2、千金子素L8、6(17),12(E)-千金二萜醇-5,15-二乙酸-3-苯乙酸酯在Caco-2细胞中的代谢产物及途径。方法:100μg/mol千金子二萜类化合物作用于Caco-2细胞3、6、12 h后收集并纯化样品,LC/MS/MS分析鉴定代谢产物。结果:千金子素L1在Caco-2细胞中首先发生酯基水解,然后再被甲基化,最终鉴定得到两个甲基化产物;千金子素L2、千金子素L8及6(17),12(E)-千金二萜醇-5,15-二乙酸-3-苯乙酸酯各鉴定出一个酯基水解产物。结论:千金子素L1在Caco-2细胞中主要代谢途径为酯基水解和甲基化;千金子素L2、千金子素L8及6(17),12(E)-千金二萜醇-5,15-二乙酸-3-苯乙酸酯在Caco-2细胞中主要代谢途径为酯基水解。LC/MS/MS可以快速、灵敏地鉴定千金子素L1、千金子素L2、千金子素L8及6(17),12(E)-千金二萜醇-5,15-二乙酸-3-苯乙酸酯在Caco-2细胞中代谢产物。

液相色谱-串联质谱测定鸡肉中喹乙醇残留标示物3-甲基喹恶啉-2-羧酸

建立了简便、灵敏、科学和可靠的液相色谱-串联质谱测定鸡肉中喹乙醇残留标示物3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)的分析方法。采用给鸡灌服喹乙醇的方式,获得含MQCA的鸡肉试样,比较了酶解、酸解和碱解等方法水解鸡肉中MQCA的效率,实验表明,碱水解鸡肉组织得到最高含量的MQCA。样品经1.0 mol/L氢氧化钠溶液水解,正己烷除脂,MAX混合型阴离子交换固相萃取柱直接净化,采用C_(18)反相色谱柱分离,质谱选择反应监测模式检测。结果表明:MQCA在1.0~100μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r^2)大于0.99;方法检出限为0.4μg/kg。在1.0、5.0和50.0μg/kg 3个添加水平下,采用外标法定量,MQCA的平均回收率为71.7%~82.4%,采用内标法定量,其回收率为96.3%~103.7%,相对标准偏差均小于6.0%。该方法适用于动物性食品中3-甲基喹恶啉-2-羧酸残留的日常监测。

液相色谱-串联质谱检测血、尿中2′-氯地西泮

目的建立血、尿中2′-氯地西泮的高效液相-串联质谱(LC-MS/MS)检验方法。方法采用液液萃取对血、尿中2′-氯地西泮进行提取,经高效液相-串联质谱检验。结果在血液和尿液中2′-氯地西泮0.1~100ng/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,最低检出限为0.01ng/mL,回收率为60.67%~89.03%。结论通过实验验证该方法真实可靠,且灵敏度高,易于操作,能用于血尿检材中2′-氯地西泮的检验。

UPLC-MS/MS法测定利奈唑胺及其中间体(S)-N-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺中的遗传毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇

目的建立液质联用色谱法(UPLC-MS/MS)同时测定利奈唑胺及其中间体(S)-N-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺中的基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇。方法采用Agilent Poroshell 120 EC-C_(18)色谱柱,流动相为0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液(梯度洗脱),流速为0.3 mL·min^(-1),柱温为35℃,进样量为2μL,电喷雾离子源,正离子模式,多反应监测模式(MRM)测定,定量离子对为质荷比(m/z)110.0→91.9,定性离子对为质荷比(m/z)110.0→56.1。结果(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇在0.836~208.989 ng·mL^(-1)范围内线性关系良好(r=0.9996),检测限为0.279 ng·mL^(-1),定量限为0.774 ng·mL^(-1),利奈唑胺中该杂质平均加样回收率在96.6%~97.6%(RSD<2%),中间体中该杂质平均加样回收率在101.6%~105.6%(RSD<2%)。3批利奈唑胺中均未检出该杂质,3批中间体中该杂质含量均小于0.05%。结论本法灵敏、可靠,可用于利奈唑胺及其起始原料(S)-N-(2-乙酰氧基-3-氯丙基)乙酰胺中基因毒性杂质(S)-1-氨基-3-氯-2-丙醇的测定。

马兜铃酸Ⅳ_a与2′-脱氧核苷体外反应形成加合物的LC-MS/MS研究

目的 利用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)研究马兜铃酸Ⅳ_a(aristolochic acid Ⅳ_a,AA Ⅳ_a)与2′-脱氧核苷在溶液中的反应,检测可能的加合物,为进一步研究奠定基础。方法 马兜铃酸Ⅳ_a与2′-脱氧腺嘌呤核苷或2′-脱氧鸟嘌呤核苷在锌尘存在下37℃孵育,通过LC-MS/MS中性丢失模式筛选反应产物,再通过质谱碎裂方式和高分辨质谱进行验证。结果 马兜铃酸Ⅳ_a与2′-脱氧腺嘌呤核苷或2′-脱氧鸟嘌呤核苷的反应较为复杂,产生多种产物。根据预期的加合物分子量(分别为558和574)以及是否具有明显的[MH-116]+子离子,分别筛选到3种和4种可能的2′-脱氧腺嘌呤核苷和2′-脱氧鸟嘌呤核苷加合物。同时,还发现了非“常规”的加合物。在马兜铃酸Ⅳ_a与2′-脱氧腺嘌呤核苷反应混合物中,发现了1种分子量572的可能加合物,而在马兜铃酸Ⅳ_a与2′-脱氧鸟嘌呤核苷反应混合物中则发现了3种分子量590的可能加合物。结论 马兜铃酸Ⅳ_a与2′-脱氧腺嘌呤核苷或2′-脱氧鸟嘌呤核苷体外条件下能够发生反应形成可能的加合物,但加合物结构尚需通过核磁共振光谱确定。

固相支撑液液萃取-液相色谱-质谱检测全血中氟阿普唑仑和2-氯地西泮

目的建立固相支撑液液萃取结合液相色谱-质谱(SLE-LC-MS)检验全血中氟阿普唑仑和2-氯地西泮的方法。方法经固相支撑液液萃取(经测试,其优于液液或固相萃取法)柱提取净化,应用电喷雾离子源(ESI)、多反应监测(MRM)正离子模式质谱进行定性及定量检验血样中氟阿普唑仑和2-氯地西泮。通过优化固相支撑液液萃取条件、色谱和质谱条件,采用液相色谱-质谱定性定量分析全血中氟阿普唑仑和2-氯地西泮。结果三种方法(液液萃取法、固相萃取法、固相支撑液液萃取法)萃取全血中氟阿普唑仑和2-氯地西泮,结果显示固相支撑液液萃取法的回收率最高。在5~500ng/mL范围内全血中氟阿普唑仑和2-氯地西泮与峰面积呈现良好的线性关系(R2=0.999),氟阿普唑仑和2-氯地西泮的最低检出限分别为0.05ng/mL和0.1ng/mL,平均基质效应分别为77.5%和72.5%,平均回收率分别为95%和79%,方法处理效率分别为73%和72%。结论该实验方法操作简单,结果准确,能满足全血中氟阿普唑仑和2-氯地西泮的检验需求。

液质联用法测定塑胶中2-巯基苯并噻唑

采用丙酮作为萃取溶剂,对待测样品进行超声萃取,用超高效液相色谱-二极管阵列-质谱联用仪对2-巯基苯并噻唑进行检测。在优化的分析条件下,2-巯基苯并噻唑在4 min时间内可以得到很好的色谱峰,并能获得很好的分离效果,0.1~10 mg/L的浓度范围内线性良好,两种检测器的线性相关系数均大于0.999,检出限达到0.1 mg/L,重复性实验得到相对标准偏差小于5%,加标回收率为90%~110%.本方法简便快捷、准确可靠,满足2-巯基苯并噻唑的检测要求。

AGR2在结直肠癌中的表达及意义

目的初步探讨前梯度蛋白2(Anterior Gradient-2,AGR2)在结直肠癌组织中的表达及临床意义。用以定义新的结直肠癌的生物标志物。方法结直肠癌组织与癌旁组织中蛋白质表达谱由二维色谱与质谱联用技术(LCMS)完成,蛋白表达情况通过免疫印迹验证。结果被筛选的结直肠癌组织和癌旁组织中的差异蛋白共39个,其中19个为上调表达蛋白。结论 AGR2在结直肠癌组织中表达上调,可能是新的结直肠癌的生物标志物。