过量氟对小鼠髁突软骨损伤及自噬相关因子LC3、p62表达的影响

目的:研究过量氟对小鼠髁突软骨损伤及髁突软骨中自噬相关因子的表达。方法:将30只4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和实验组,每组15只,对照组自由饮用去离子水,实验组自由饮用含氟离子浓度为75 mg/L的去离子水,持续喂养8周。通过改良番红O-固绿软骨染色观察髁突纤维软骨层结构变化;免疫组织化学染色检测软骨细胞外基质降解标志物基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 13,MMP-13)、Ⅱ型胶原蛋白的表达水平及自噬相关因子微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、自噬底物蛋白p62的表达水平。采用SPSS 22.0软件包对免疫组织化学染色半定量结果进行双因素方差分析。结果:与对照组相比,实验组纤维软骨层变薄,软骨细胞体积变小,核变小,染色加深。免疫组织化学染色结果显示,实验组MMP-13表达量增加,Ⅱ型胶原蛋白表达量降低;LC3表达量增加,p62表达量下降。结论:用含氟离子浓度为75 mg/L的去离子水喂养小鼠8周,可导致髁突软骨退变,髁突软骨发生自噬。

自噬相关分子mTOR、Beclin-1及LC3在胸腔积液中的表达及临床意义

目的:探讨自噬相关分子mTOR、Beclin-1及LC3在良恶性胸腔积液中的表达,分析其临床意义。方法:通过液基薄层细胞学检查及免疫组化检查并结合患者临床资料纳入300例胸腔积液标本作为研究对象,分为group165例(漏出性胸腔积液组)、group2142例(非肿瘤炎性胸腔积液组)及group393例(非小细胞肺癌性胸腔积液组),通过RT-PCR方法及Western blot方法分别检测各组胸腔积液中mTOR、Beclin-1及LC3在基因及蛋白水平的表达。结果:在基因和蛋白表达水平,group1及group2相较于group3在Beclin-1和LC3的表达水平均升高,而mTOR的表达则显著减低,差异均有统计学意义;同时,group2较group1在Beclin-1和LC3表达中均降低,mTOR的表达则升高,差异均有统计学意义;此外在良、恶性胸腔积液相关性分析中发现,在蛋白水平Beclin-1相对表达值与LC3表达值呈正相关,而mTOR相对表达值与Beclin-1、LC3表达值呈负相关。结论:自噬相关分子mTOR、Beclin-1及LC3在不同性质胸腔积液中表达存在差异,可能与炎性及非小细胞肺癌引起的肿瘤性胸腔积液的发病机制有关,可为胸腔积液性质鉴定提供新的分子学依据。

结直肠癌患者外周血中LC3B^(+)EVs与MDSC及各细胞因子水平的临床相关性分析

目的:为探讨丹阳地区结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者外周血中LC3B^(+)EVs与髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)及各细胞因子的水平及其临床相关性。方法:流式细胞仪分别检测两组健康体检者和CRC患者外周血中LC3B^(+)EVs、MDSC及粒系髓源性抑制细胞(PMN-MDSC)和单核系髓源性抑制细胞(M-MDSC)的水平,讨论LC3B^(+)EVs与MDSC的临床相关性,并将CRC患者的血浆标本中的效应分子进行多因子检测(细胞因子芯片),讨论LC3B^(+)EVs与各因子的相关性。结果:与对照组相比,CRC患者外周血LC3B^(+)EVs数量显著上升(P<0.0001),且与患者年龄、性别无统计学差异(P=0.8690,P=0.9712)。CRC患者外周血中MDSC及PMN-MDSC、M-MDSC两个亚群的水平升高皆有统计学意义,并以PMN-MDSC增高为主(P<0.0001)。CRC患者外周血中LC3B^(+)EVs与MDSC及PMN-MDSC的水平无相关性(r=-0.002699,P=0.9891;r=-0.04435,P=0.8227),但与M-MDSC的水平呈显著正相关(r=0.4811,P=0.0096)。CRC患者外周血LC3B^(+)EVs与IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、IL-17、IFN-γ的水平呈正相关(r=0.7031、r=0.7827、r=0.4663、r=0.5901、r=0.4589、r=0.4655,P<0.05),尤其是与IL-1β呈显著正相关(P=0.0016);而与IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α的水平无统计学意义(P>0.05)。结论:CRC患者血浆中LC3B^(+)EVs数量与MDSC水平显著高于健康人,LC3B^(+)EVs与M-MDSC亚群及IL-1β的水平存在显著正相关,提示M-MDSC与IL-1β可能诱导CRC肿瘤细胞释放自噬小体增加,它们之间可能存在相互作用从而影响CRC的发生发展。

三物白散对胃癌细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3、p62表达的影响

目的:探讨三物白散对胃癌细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3、p62表达的影响,探究三物白散抗胃癌的作用机制。方法:将28只SPF级雄性大鼠随机分为4组,每组7只,分别予以0.03125、0.0625、0.1250 g/(kg·d)三物白散及相同体积生理盐水灌胃,经腹主动脉采血制备含药血清。体外培养AGS细胞,设置空白对照组(空白组)、三物白散低剂量含药血清组(低剂量组)、三物白散中剂量含药血清组(中剂量组)、三物白散高剂量含药血清组(高剂量组)。采用CCK-8法检测不同浓度(5%、10%、15%、20%)三物白散含药血清对AGS细胞活性的影响;倒置显微镜下观察三物白散含药血清对AGS细胞形态的影响;RT-qPCR法检测Beclin1 mRNA、LC3 mRNA、p62 mRNA表达;Western blotting法检测Beclin1、LC3、p62蛋白表达。结果:与空白组比较,5%、10%、15%、20%三物白散高剂量含药血清可呈浓度-时间依赖性抑制AGS细胞活性;随着含药血清浓度升高,细胞形态逐渐不规则,细胞数量逐渐减少;中、高剂量组Beclin1 mRNA、LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA相对表达量均高于空白组,p62 mRNA相对表达量低于空白组(P<0.01);低剂量组LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA相对表达量高于空白组,p62 mRNA相对表达量低于空白组(P<0.01)。高剂量组Beclin1蛋白相对表达量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均高于空白组,p62蛋白相对表达量低于空白组(P<0.01);中剂量组Beclin1蛋白相对表达量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于空白组(P<0.05或P<0.01),p62蛋白相对表达量低于空白组(P<0.01)。结论:三物白散对胃癌细胞的增殖有抑制作用,上调Beclin1、LC3表达、下调p62的表达、诱导胃癌细胞自噬可能是其抗胃癌作用机制之一。

怡肾丸对单侧输尿管结扎模型大鼠LC3及Beclin-1表达的影响

目的:探讨怡肾丸对单侧输尿管结扎模型大鼠肾脏LC3及Beclin-1表达的影响。方法:将64只雄性SD大鼠随机分为假手术组(16只)、UUO模型组(16只)、UUO模型+怡肾丸组(16只)、UUO模型+依那普利组(16只)。手术组大鼠游离并结扎左侧输尿管制备肾纤维化模型,假手术组只游离不结扎左侧输尿管。各给药组于造模当日开始给予相应药物,假手术组和模型组灌胃等体积蒸馏水,连续灌胃3周。于术后第3、7、21天分批处死各组大鼠,取血清及左肾标本,检测血清肌酐、尿素氮,HE染色、Masson染色观察其病理形态学改变,免疫组织化学法及qRT-PCR法分别检测肾组织LC3及Beclin-1的蛋白及mRNA表达水平。结果:与假手术组相比,模型组血肌酐、尿素水平均升高(P<0.01);与模型组相比,治疗组肾功能上升速度缓慢(P<0.05);假手术组大鼠肾脏未见明显病理改变。模型组大鼠肾小球硬化,肾小管高度扩张萎缩,小管基底膜变薄,间质区细胞大量增生及纤维化,并随梗阻时间延长而加重,治疗组病理损伤明显减轻,胶原纤维沉积减少(P<0.05);与假手术组相比,模型组的LC3、Beclin1水平升高(P<0.05);与模型组相比,治疗组的LC3、Beclin1表达水平显著上升(P<0.05)。结论:UUO大鼠肾损害过程中自噬被激活,而怡肾丸增强了LC3、Beclin-1自噬相关蛋白的表达水平,并减轻肾纤维化以保护肾脏。

长链非编码RNAH19及自噬相关基因LC3Ⅱ在结直肠癌中表达及其意义

探讨长链非编码RNA-H19 (long noncoding RNA, LncRNA-H19)在结肠腺癌中的自噬及临床病理因素的相关性,研究其临床意义。方法 采用生物信息学分析探讨lncRNA-H19在结肠腺癌中的表达水平、临床相关性和预后。在76例结直肠腺癌及癌旁组织石蜡标本中,采用qRT-PCR方法检测LncRNA H19和LC3Ⅱ的表达情况,利用免疫组织化学方法检测LC3Ⅱ蛋白的表达,并进行数据分析。结果 生物信息学分析结果表明,LncRNA H19在结直肠腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,无病间隔及无进展间隔预后均提示LncRNA H19的高表达在结直肠腺癌患者中预后相对较差,伴随肿瘤恶化,LncRNA H19的表达逐渐升高。根据qRT-PCR方法和免疫组织化学方法结果显示,结直肠腺癌中的LncRNA H19和LC3Ⅱ表达均有所增加,这与结直肠腺癌的发展进程密切相关。相关性分析揭示,LncRNA H19与LC3Ⅱ之间存在负相关关系。结论 在结直肠腺癌研究中,lncRNA-H19高表达,可能通过抑制自噬进而推动结直肠癌肿瘤的发生发展。

抗衰延年方对D-半乳糖致衰老大鼠海马自噬相关蛋白LC3的影响

[目的]研究抗衰延年方对D-半乳糖所致衰老大鼠海马自噬相关蛋白微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)的影响。[方法]采用皮下注射D-半乳糖的方法制备大鼠衰老模型,再按随机数字表法将造模成功的21只大鼠分为模型组、抗衰延年方组、吡拉西坦组,每组7只,另将7只健康大鼠设置为正常对照组。抗衰延年方组予抗衰延年方水煎剂灌胃治疗,吡拉西坦组予吡拉西坦灌胃治疗,正常对照组和模型组不予其他干预性治疗。治疗21 d后,采用Morris水迷宫检测各组大鼠的学习和记忆功能,免疫组织化学法和Western blot法检测大鼠海马组织LC3蛋白的表达。[结果]模型组大鼠搜寻平台时间与正常对照组相比明显延长(P<0.05或P<0.01),吡拉西坦组、抗衰延年方组与模型组比较均明显缩短(P<0.05或P<0.01);与正常对照组相比,模型组大鼠穿越平台次数明显减少(P<0.01),吡拉西坦组、抗衰延年方组较模型组明显增加(P<0.05);模型组大鼠脑海马组织LC3蛋白表达较正常对照组升高(P<0.05),吡拉西坦组、抗衰延年方组较模型组降低(P<0.05)。[结论]抗衰延年方可通过降低脑组织LC3蛋白水平,从而达到延缓衰老的目的,其作用效果与吡拉西坦相当。

伊立替康、紫杉醇联合顺铂治疗对宫颈癌CYFRA21-1、VEGF-C及LC3-Ⅱ水平的影响

目的:分析伊立替康、紫杉醇联合顺铂治疗对宫颈癌的治疗效果及对细胞角蛋白19片段抗原21-1(Cytokeratin 19 fragment 21-1,CYFRA21-1)、血管内皮生长因子C(Vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3-Ⅱ)水平的影响.方法:回顾性分析本院2020年3月至2023年4月收治的122例宫颈癌患者的临床资料,根据治疗方案不同将患者分为IP组(伊立替康+顺铂治疗,60例)和TP组(紫杉醇+顺铂治疗,62例).分析对比两组的临床疗效、CYFRA21-1、VEGF-C及LC3-Ⅱ水平以及毒副反应.结果:IP组与TP组总疗效率分别为56.67%、79.03%,TP组总疗效率显著高于IP组(P<0.05).两组治疗后的CYFRA21-1、VEGF-C及LC3-Ⅱ水平均显著下降,且TP组CYFRA21-1、VEGF-C及LC3-Ⅱ水平均显著低于IP组(P<0.05).TP组0度、Ⅰ度例数占比显著高于IP组,Ⅲ度例数占比显著低于IP组(P<0.05).结论:与伊立替康联合顺铂比较,紫杉醇联合顺铂治疗宫颈癌临床疗效更为理想,可有效降低CYFRA21-1、VEGF-C及LC3-Ⅱ水平,且安全性高.

金欣康颗粒提高线粒体自噬蛋白LC3/Beclin1表达改善心力衰竭大鼠心肌纤维化的研究

目的探讨金欣康颗粒(丹参、桂枝、黄芪、人参、毛冬青等7味药组成)对心力衰竭(简称心衰)大鼠线粒体自噬蛋白LC3/Beclin1表达的影响,阐述金欣康颗粒改善心梗后心衰心肌纤维化的机制。方法复制心梗后心衰大鼠模型。将造模成功的心衰大鼠随机分为4组:模型组,金欣康颗粒低剂量组、高剂量组和培哚普利组,另设假手术组,每组10只。给药12周,以HE染色、天狼猩红染色评估心肌组织的病理变化,心脏彩超对心脏结构和心功能进行评估,透射电镜观察自噬小体,免疫组化法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型和Ⅲ型胶原(CollagenⅠ和CollagenⅢ)蛋白的表达,Western Blot法检测自噬蛋白LC3、Beclin1的表达。结果成功复制心梗后心衰大鼠模型,模型组大鼠梗死区周边区域有大量红色的胶原沉积,心肌纤维排列紊乱,部分纤维断裂;线粒体明显肿胀,出现峭断裂,能观察到较多的自噬小体。金欣康颗粒组和培哚普利组心肌纤维排列较模型组整齐,纤维化程度较轻,自噬小体更加明显。与假手术组比较,模型组的射血分数(LVEF)和短轴缩短率(LVFS)显著降低(P<0.01),左室舒张末期内径(LVEDd)及收缩末期内径(LVEDs)增大(P<0.01),α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ表达水平升高(P<0.05),线粒体自噬蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达升高(P<0.05);与模型组比较,金欣康颗粒组和培哚普利组LVEF和LVFS明显提高(P<0.01),心功能得到改善;α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白表达降低(P<0.05),Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达升高(P<0.05)。结论金欣康颗粒可减轻心梗后心衰大鼠的心肌纤维化程度,其机制可能与增强线粒体自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1的表达有关。

真武汤、越婢汤对阿霉素肾病大鼠肾组织自噬相关基因PTEN/LC3的影响

目的观察真武汤、越婢汤对阿霉素肾病大鼠肾组织磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)及肾脏自噬标志性分子微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)表达的影响。方法将SD大鼠随机分为空白组、模型组、真武汤组(真武组)、越婢汤组(越婢组),每组12只。用阿霉素复制肾病综合征大鼠模型。造模成功后空白组和模型组以生理盐水灌胃,中药两组分别以真武汤和越婢汤颗粒剂灌胃,6周后检测血清白蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及24 h尿蛋白定量(24-hour urine total protein quantity,24 h UTP)等,光镜观察肾脏病理,免疫组化观察大鼠肾组织PTEN、LC3的表达。结果与空白组相比,模型组肾脏病理可见部分肾小球肥大、毛细血管腔变窄,肾小管扩张、管腔可见蛋白质管型,间质可见炎性细胞浸润等;24 h UTP及Scr、BUN升高,ALB、LC3及PTEN表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,中药两组肾脏病理改善,24 h UTP、Scr明显下降,ALB升高,肾组织LC3、PTEN表达增强,差异有统计学意义(P<0.05)。而真武组与越婢组比较无明显差异。结论真武汤和越婢汤均能改善阿霉素肾病大鼠的生化指标及肾脏病理,其作用机制可能与升高肾组织PTEN、LC3表达有关。

牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用

旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)基因,制备牦牛LC3B多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。本研究通过基因克隆方法获得牦牛LC 3B基因序列,利用原核表达、亲和层析法纯化牦牛LC3B重组蛋白,使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔,Sepharose4B柱层析法纯化制备牦牛LC3B多克隆抗体,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价,并使用蛋白质免疫印迹(WB)、免疫组织化学法(IHC)和免疫荧光技术(IF)检测牦牛生殖器官中LC3B蛋白的表达。结果显示,本研究成功克隆了牦牛LC 3B基因(登录号:OP572227),构建的重组质粒pET-32a-LC3B能够诱导产生重组蛋白,并且在包涵体和上清中均有表达;所纯化的牦牛LC3B重组蛋白大小为34 ku(含Trx和His标签),符合预期结果。通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛LC3B蛋白血清,抗体效价分别为1∶640000和1∶320000,特异性良好,表明牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备成功。纯化后的抗体应用于牦牛生殖器官中LC3B的表达检测,LC3B在牦牛卵巢、输卵管和子宫中表达,并且能识别LC3B-Ⅰ和发生脂化后的LC3B-Ⅱ,主要表达于细胞质及细胞核周。本研究通过成功克隆牦牛LC 3B基因制备了牦牛LC3B多克隆抗体,使用抗体检测发现LC3B蛋白在牦牛生殖器官中均有表达,表明所制备的多克隆抗体特异性良好,能够应用于牦牛LC3B蛋白的检测和细胞自噬水平的研究。

益肾胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织LC3Ⅱ、p62表达的影响

目的:探讨益肾胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织LC3Ⅱ、p62表达的影响。方法:将40只雄性SD大鼠,随机分为正常组、糖尿病肾病组、益肾胶囊组、白藜芦醇组,每组10只。益肾胶囊组给予益肾胶囊(0.625 g·kg^(-1)·d^(-1))灌胃、白藜芦醇组给予白藜芦醇(30 mg·kg^(-1)·d^(-1))灌胃、正常组和糖尿病肾病组每日给予等量生理盐水灌胃,时间为8周。观察大鼠一般状态,在0、4、8周末测定大鼠体重、血糖及24 h尿蛋白定量;并在8周末于大鼠腹主动脉取血,测定肌酐(Scr)、尿素(BUN)、胆固醇(TC)、三酰甘油(TG),用HE、PAS染色法分别观察肾脏组织病理变化,用免疫组化法测定自噬相关蛋白LC3Ⅱ及泛素结合蛋白p62(p62/SQSTMI)的表达变化。结果:(1)与正常组相比,糖尿病肾病组Scr、BUN、TC、TG、24 h尿蛋白定量均有所升高(P<0.05);与糖尿病肾病组相比,益肾胶囊组及白藜芦醇组Scr、BUN、TC、TG、24 h尿蛋白定量均有所下降(P<0.05);(2)与正常组相比,糖尿病肾病组镜下肾组织系膜基质增生较明显,肾小管管腔狭窄,上皮细胞水肿,呈现空泡样变性,足细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达减少(P<0.05),p62表达增多(P<0.05);与糖尿病肾病组相比,益肾胶囊组及白藜芦醇组肾组织病理改变明显减轻,足细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达增加(P<0.05),p62表达减少(P<0.05)。结论:益肾胶囊可能通过改善糖尿病肾病大鼠肾组织的自噬障碍,从而对糖尿病肾病的肾脏发挥保护作用。

基于mTOR/Beclin1/LC3信号轴探讨制萎扶胃丸对胃癌前病变大鼠胃窦组织自噬的影响

目的:探讨制萎扶胃丸(ZWFW)对胃癌前病变(PLGC)大鼠胃窦组织哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1)/微管相关蛋白1轻链3(LC3)信号轴关键分子表达的影响。方法:SPF级SD大鼠随机分为正常组,模型组,叶酸组,ZWFW低、中、高剂量组,除正常组常规饲养外,模型组、叶酸组、ZWFW低、中、高剂量组,采用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)联合饥饱失常、乙醇灌胃、氨水自由饮用以及雷尼替丁饲料喂养五因素复合造模法建立PLGC大鼠模型后,分别用生理盐水、叶酸片水溶液(0.002 g/kg)、ZWFW低、中、高剂量水溶液(0.42,0.84,1.67 g/kg)予以治疗4周后剖腹取胃。采用苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠胃窦组织病理学变化,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)及免疫组化检测大鼠胃窦组织mTOR、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的mRNA及蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠胃窦组织胀大,胃壁变薄,胃黏膜色泽苍白,皱襞萎缩浅平,走行紊乱,可见结节及赘生物;HE染色示:与正常组比较,模型组胃黏膜腺体排列拥挤、紊乱,细胞形态不一,可见大量杯状细胞,细胞浆嗜碱性,细胞核大、深染、不规则,黏膜肌层浸润破坏;与模型组比较,ZWFW显著改善了胃黏膜腺体结构排列紊乱和细胞异型性等病理表现。与正常组比较,模型组大鼠胃窦组织m TOR mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05),Beclin1和LC3B mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,ZWFW中、高剂量组胃窦组织mTOR mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),ZWFW低剂量组胃窦组织Beclin1、LC3B蛋白表达升高(P<0.05),中、高剂量组胃窦组织Beclin1、LC3B mRNA和蛋白表达升高(P<0.05)。结论:ZWFW可显著改善PLGC模型大鼠胃黏膜异常组织病理学表现,其机制可能与下调mTOR表达,上调Beclin1、LC3B表达进而促进自噬相关。

NIX和LC3-Ⅱ在成年牦牛不同脑组织中的表达与定位分析

为了探讨牦牛(Bos grunniens)脑组织低氧适应性,选择成年(3~5岁)牦牛脑组织,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫组织化学技术及免疫荧光技术检测低氧诱导因子2α(HIF2α)与促凋亡BNIP3L蛋白(BNIP3L/NIX)和微管相关蛋白轻链3(LC3-Ⅱ)在大脑皮质、海马、丘脑、延髓和小脑中的表达与定位情况,并用半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)检测脑组织中细胞的凋亡水平。qRT-PCR和免疫组织化学光密度分析结果显示,成年牦牛大脑皮质和海马的HIF2α、NIX、LC3-ⅡmRNA和蛋白水平显著高于丘脑、延髓及小脑(P<0.05),另外Caspase-3 mRNA和蛋白水平在五个部位之间无显著差异。免疫组化镜下观察发现HIF2α阳性反应表达于神经元胞核及胞质,而NIX、LC3-Ⅱ和Caspase-3阳性反应均集中在细胞质,且上述四个因子主要分布于大脑皮质的多形细胞层和海马的CA区锥体细胞层,另外,在丘脑、延髓和小脑神经元中均有表达。免疫荧光结果显示,HIF2α、NIX、LC3-Ⅱ与神经元核抗原抗体NeuN在上述各部位神经元细胞共定位,Caspase-3荧光强度较弱。以上结果表明,海马和大脑皮质可能更容易受到低氧刺激;另外,HIF2α的表达可能促进NIX和LC3-Ⅱ的表达,降低Caspase-3表达水平,从而使牦牛大脑和海马适应高原环境。本试验为深入研究牦牛中枢神经系统的低氧适应机制提供了基础数据。

芍药甘草汤对Oddi括约肌功能障碍豚鼠自噬相关蛋白Beclin1和LC3-B的影响

目的探讨芍药甘草汤对豚鼠Oddi括约肌功能障碍的治疗作用及其对自噬相关蛋白Beclin1和LC3-B表达的影响。方法30只豚鼠随机分为正常组、模型组和芍药甘草汤治疗组,每组10只。模型组和芍药甘草汤组按0.6 mg/kg体质量静脉注射吗啡注射液以诱导Oddi括约肌功能障碍模型,正常组豚鼠予等体积0.9%氯化钠溶液静脉注射,每周三次;从第一次造模起,芍药甘草汤组按12.5 g/kg灌胃治疗;正常组和模型组分别予等体积0.4%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)灌胃,1次/d,共计4周。末次给药后禁食,收集血清和Oddi括约肌组织。全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;H&E染色检测Oddi括约肌病理变化;qRT-PCR检测c-Kit、Beclin1、LC3-B mRNA表达;Western blot检测c-Kit、Beclin1、LC3-B蛋白表达。结果(1)与对照组相比,模型组豚鼠血清ALT、AST水平显著增高(P<0.01);与模型组相比,芍药甘草汤组豚鼠血清ALT、AST水平均明显下降(P<0.05)。(2)H&E染色显示,模型组豚鼠Oddi括约肌纤维排列不规则、部分紊乱,并可见炎性细胞浸润,黏膜下纤维组织增生明显、平滑肌层显著增厚;与模型组相比,芍药甘草汤组豚鼠Oddi括约肌组织中纤维排列紊乱、炎性细胞浸润及黏膜下纤维组织增生明显改善。(3)与正常组相比,模型组豚鼠Oddi括约肌中c-Kit的mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05),自噬相关Beclin1和LC3-B的mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.01,P<0.05);与模型组相比,芍药甘草汤组c-Kit的mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.01),Beclin1和LC3-B的mRNA和蛋白表达则显著减少(P<0.01)。结论芍药甘草汤可有效治疗吗啡诱导的豚鼠Oddi括约肌功能障碍,其作用机制可能是与减少细胞过度自噬、提升Cajal细胞活性有关。

基于LC3D的摔倒行为识别算法

针对传统的三维卷积神经网络(C3D)用于摔倒行为识别时对特征的提取不明显,而传统的长短时记忆网络(LSTM)存在梯度消失的问题,提出一种新的基于时序三维卷积网络(LC3D)的摔倒行为识别算法。该算法同步获取视频和骨架两组数据,将视频数据和骨架数据分别输入至改进后的C3D网络和LSTM网络进行训练并提取摔倒行为的C3D模型和LSTM模型;通过Stacking算法将两个模型进行融合得到LC3D模型;利用LC3D模型对摔倒行为进行识别。实验结果表明,使用LC3D网络识别摔倒行为比使用传统三维卷积网络和长短时记忆网络算法的准确率更高。

胃癌组织中LC3、ATG5和SATB2-AS1在不同部位表达与临床病理特征及预后的相关性

目的探究胃癌组织中LC3、ATG5和SATB2-AS1在不同部位表达与临床病理特征及预后的相关性。方法选取胃癌患者50例,收集患者临床资料。免疫组化法检测LC3、ATG5表达,以及RT-PCR检测SATB2-AS1表达,分析其在不同部位的表达与临床病理特征的关系。采用多因素回归模型分析影响胃癌预后的独立因素。结果胃癌中LC3在癌周和癌巢表达与患者肿瘤分化程度、淋巴结转移情况有关(P<0.05);ATG5在癌周表达与患者肿瘤分化程度、肿瘤分期有关(P<0.05),ATG5在癌巢表达与患者肿瘤分化程度、肿瘤分期和淋巴结转移情况有关(P<0.05);SATB2-AS1在癌周表达与患者肿瘤分化程度、肿瘤最大直径有关(P<0.05),SATB2-AS1在癌巢表达与患者肿瘤分化程度、肿瘤最大直径和临床分期有关(P<0.05)。单因素分析发现分化程度、淋巴结远处转移、癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表达是影响胃癌预后的因素(P<0.05)。多因素分析显示肿瘤分化程度、淋巴结远处转移、癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表达是影响胃癌预后的独立危险因素(P<0.05)。结论胃癌癌周和癌巢组织中LC3、ATG5和SATB2-AS1表达与临床病理特征存在相关性,癌巢组织LC3、ATG5和SATB2-AS1表达可作为预测胃癌患者预后的生物标志物。

火针对膝骨关节炎大鼠关节软骨细胞自噬相关蛋白LC3及血清炎症因子的影响

目的:观察火针对膝骨关节炎大鼠膝关节软骨细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3及血清炎症因子的影响。方法:将36只健康SD大鼠随机分为空白对照组(8只)和造模组(28只),采用改良Hulth法制备膝骨关节炎模型,6周后随机选取造模组4只大鼠处死,行关节软骨病理学检查判定模型制备是否成功,随后将剩余24只大鼠随机分为模型对照组、西药组、火针组,每组8只。火针组给予火针治疗干预,每周2次;西药组给予盐酸氨基葡萄糖片溶液1.6 mL(0.384 mg)灌胃,每日1次;空白对照组、模型对照组给予等量生理盐水灌胃,每日1次。各组均以4周为1个疗程。1个疗程结束后,采集各组大鼠血清、关节软骨,采用ELISA法、PCR法对血清标本的基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、MMP-13、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、LC3水平进行检测;HE染色法观察关节软骨组织形态结构。结果:与空白对照组比较,模型对照组、西药组、火针组MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表达升高(P<0.05),LC3表达降低(P<0.05);与模型对照组比较,火针组MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表达降低(P<0.05),LC3表达升高(P<0.05);与西药组比较,火针组MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表达降低(P<0.05),LC3表达升高(P<0.05)。关节软骨病理切片显示,火针组关节腔隙明显,软骨表面毛糙,滑膜组织有少量破损,炎性细胞浸润但少于模型对照组,部分潮线破坏,软骨细胞排列尚均匀。结论:火针可降低血清炎性因子含量,上调自噬标志性蛋白LC3的表达,抑制膝骨关节炎炎症反应,缓解炎性浸润,减轻软骨细胞的破坏,改善其病理状态。

毛蕊花糖苷对腺嘌呤所致不育症大鼠的影响

目的 探讨毛蕊花糖苷对腺嘌呤诱导的不育症大鼠的作用及其机制。方法 大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组(100 mg/kg复方玄驹胶囊)和毛蕊花糖苷低、高剂量组(50、100 mg/kg)。除空白组外,其余各组每天灌胃150 mg/kg腺嘌呤,连续14 d,建立不育症大鼠模型。造模结束后,各组灌胃给予相应剂量药物,连续给药28 d。观察各组大鼠一般活动情况,计算脏器(肝脏、肾脏、睾丸、附睾)指数,于显微镜下观察精子情况,HE染色观察大鼠肝脏、肾脏及睾丸组织病理形态,并进行精子发生评估(Johnsen评分法),ELISA法检测血清T、LH、FSH、GnRH水平,RT-qPCR和Western blot法检测大鼠睾丸组织mTOR、LC3B、ULK1 mRNA和蛋白表达。结果 与空白组比较,模型组大鼠肾脏指数升高(P<0.05),精子计数、精子活动率及精子指数降低(P<0.05),血清T、GnRH水平降低(P<0.05),LH、FSH水平升高(P<0.05),肾脏和睾丸组织病理损伤明显,睾丸组织mTOR mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),LC3B、ULK1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),p-mTOR蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,毛蕊花糖苷高剂量组肾脏指数降低(P<0.05),精子计数、精子活动率升高(P<0.05),血清T水平升高(P<0.05),LH、FSH水平降低(P<0.05),肾脏和睾丸组织病理损伤有不同程度改善,睾丸组织mTOR mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),LC3B、ULK1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),p-mTOR蛋白表达升高(P<0.05),且毛蕊花糖苷高剂量作用与阳性对照药复方玄驹胶囊相当。结论 毛蕊花糖苷能有效提高不育症大鼠的精子质量,改善性激素紊乱、生殖功能及肾脏、睾丸组织病理性损伤,其作用机制可能与增强正性调控自噬,调节下丘脑-垂体-睾丸轴紊乱有关。

猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究

为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬。构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集。进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答。为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapamycin处理Vero E6细胞后以SADS-CoV感染,于感染后不同时间收获细胞,通过western blot和病毒滴度(TCID_(50))测定检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与仅感染病毒的对照组相比,采用3-MA处理Vero E6细胞后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)均显著降低(P<0.05),而采用Rapamycin处理后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)则均显著升高(P<0.05)。针对ATG5基因设计3条特异性的ATG5 si RNA(siATG5-1/2/3),将干扰效率较好的siATG5-1转染Vero E6细胞后再以SADS-CoV感染,24 h后检测病毒滴度并利用western blot检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与未转染siATG5的3组阴性细胞相比,转染细胞中SADS-CoV N蛋白的表达水平及病毒滴度均显著降低(P<0.05)。本研究首次表明SADS-CoV感染可以诱导宿主细胞自噬并促进病毒的复制,该结果为深入研究SADS-CoV感染与其致病机理以及防控该病毒的感染奠定了基础。