伊班膦酸钠对膝骨关节炎大鼠自噬相关蛋白LC3 Ⅱ的影响

目的:研究伊班膦酸钠对膝骨关节炎大鼠自噬相关蛋白LC3 Ⅱ的表达变化,初步探讨软骨组织中自噬相关蛋白水平与骨关节炎(osteoarthritis, OA)发生发展的关系。方法:将30只3月龄雌性SD大鼠随机分为3组,每组10只:假手术组(Sham)、生理盐水治疗组(ACLT+NS)和伊班膦酸钠治疗组(ACLT+IB)。ACLT+NS组、ACLT+IB组行膝关节前交叉韧带切断术(ACLT)建立膝骨关节炎模型。术后1周ACLT+IB组予以伊班膦酸钠干预。检测指标:番红染色、Mankin’s评分;关节软骨下骨形态学检测;大鼠血I型胶原C端肽(CTX-I)、Ⅱ型胶原C端肽(CTX-Ⅱ)及IL-1、IL-6水平;基质金属蛋白酶-13(MMP-13)及自噬相关蛋白LC3 Ⅱ表达。结果:番红染色ACLT+NS组软骨结构破坏明显,Mankin’s评分显著高于Sham组和ACLT+IB组(P <0.001);ACLT+IB组相对骨体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)等均明显高于ACLT+NS组(P<0.001),骨小梁分离度(Tb.Sp)则显著低于ACLT+NS (P <0.001);ACLT+NS组血清CTX-I、CTX-Ⅱ、IL-1、IL-6水平高于Sham组和ACLT+IB组(P <0.05);相比较于Sham组和ACLT+IB组,ACLT+NS组的MMP-13表达水平增高(P <0.01),LC3 Ⅱ表达降低(P <0.01)。结论:伊班膦酸钠能够下调MMP-13蛋白表达,并减少炎性因子IL-1和IL-6分泌,进而保护关节软骨,改善软骨下骨小梁微观结构,可能与自噬相关蛋白LC3 Ⅱ表达增高有关。

平喘颗粒对哮喘大鼠肺组织Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达的影响

目的:通过测定Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达,探讨平喘颗粒对哮喘大鼠自噬的抑制机理。方法:随机将30只Wistar大鼠分为3组,正常组、模型组、平喘颗粒组,每组10只。在第2次致敏后第4天开始给予给与中药药液灌胃。平喘颗粒组按体质量给予平喘颗粒溶液1 mL/100 g灌胃,激发阶段则每次激发前1h灌胃;正常组与模型组均予等量生理盐水灌胃。各组均于末次激发24 h后处死,取肺组织,光镜下观察肺组织的病理学改变。采用免疫组化SP法检测肺组织Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达。结果:平喘颗粒组和模型组大鼠肺组织Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.01);平喘颗粒组Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达较模型组明显受到抑制,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:平喘颗粒能减轻哮喘后的炎症反应,并且可抑制细胞自噬信号通路,从而保护肺部组织细胞,减轻哮喘发作。

心衰宁合剂对慢性心力衰竭大鼠心肌自噬相关蛋白表达的影响

目的探讨心衰宁合剂(XSNM)对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌自噬效应蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链(LC)3-Ⅱ表达的影响。方法将SD大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照(卡托普利组,10 mg/kg),XSNM低、中、高剂量组(15.6、31.2、62.4 g/kg),采用阿霉素(ADR,2.5 mg/kg)腹腔注射复制CHF大鼠模型,空白组注射等量生理盐水,每周1次,造模6 w。模型复制结束后各组按剂量灌胃,空白组及模型组灌胃生理盐水,灌胃4 w。采用超声心动图检测大鼠心功能;苏木素-伊红(HE)及Masson染色观察大鼠心肌病理学变化情况;透射电镜观察大鼠心肌组织超微结构;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清肌酸激酶同工酶(CK)-MB含量;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、Western印迹检测大鼠心肌Beclin1、LC3-Ⅱ基因及蛋白表达水平。结果与空白组比较,模型组左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)均显著增加(P<0.01),左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短分率(LVFS)显著降低(P<0.01),血清CK-MB明显升高(P<0.01),Beclin1、LC3-Ⅱ基因及蛋白表达较空白组明显升高(P<0.01);与模型组比较,XSNM各剂量组和卡托普利组LVEDD、LVESD均降低,LVEF、LVFS均升高,除XSNM低剂量组LVEDD外,差异均有统计学意义(P<0.01),XSNM显著降低血清CK-MB水平(P<0.01),XSNM各剂量组均降低Beclin1、LC3-Ⅱ基因及蛋白表达水平(P<0.01)。电镜结果显示模型组亚细胞结构损伤较重,XSNM有一定的改善作用,自噬小体数量有减少。结论XSNM可以改善CHF大鼠心脏功能,降低血清CK-MB含量,其机制可能与调节心肌细胞自噬有关。

醒脑静注射液对蛛网膜下腔出血大鼠学习记忆能力及海马区自噬相关蛋白表达的影响

目的 探讨醒脑静注射液对蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠学习记忆能力及海马区自噬相关蛋白表达的影响。方法 将36只大鼠随机分为假手术组、模型组、醒脑静组各12只。模型组、醒脑静组采用颈动脉穿刺法制作SAH大鼠模型,假手术组仅将纤芯沿血管穿入颅内但不刺破血管。造模成功后,醒脑静组给予醒脑静注射液2mL腹腔注射,1次/12h;假手术组和模型组给予等量生理盐水腹腔注射。术后24h进行穿梭箱实验,比较三组大鼠的逃避反应时间和逃避反应次数;处死大鼠,取海马组织,HE染色观察神经细胞形态,免疫组化法检测Beclin-1、LC3Ⅱ阳性神经细胞个数,Western blotting法检测海马组织中自噬特异性标志物Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达。结果 与假手术组比较,模型组穿梭箱实验逃避反应时间延长,逃避反应次数减少(P均<0.05);与模型组比较,醒脑静组逃避反应时间缩短,逃避反应次数增加(P均<0.05)。假手术组海马神经细胞多数形态正常;模型组胞核梭形固缩、深染情况明显增多,并有核破碎现象;醒脑静组与模型组比较,胞核梭形固缩、深染、核破碎情况明显减少。模型组海马Beclin-1、LC3Ⅱ阳性神经细胞数较假手术组增多,醒脑静组较模型组增多(P均<0.05)。与假手术组比较,模型组海马组织中Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达升高(P均<0.05);与模型组比较,醒脑静组Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表达升高(P均<0.05)。结论 醒脑静可改善SAH大鼠的学习记忆能力,保护脑神经功能,其机制可能与激活SAH大鼠海马区神经细胞自噬相关蛋白表达有关。

接受自体动静脉内瘘术的兔动静脉吻合口静脉端颈外静脉内膜厚度及自噬相关蛋白表达观察

目的 观察接受自体动静脉内瘘(AVF)术的兔动静脉吻合口静脉端颈外静脉内膜厚度及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62的表达情况。方法 30只雄性新西兰兔,麻醉后切开皮肤,解剖分离出左侧颈总动脉和颈外静脉,进行端-侧吻合,记为实验组;同时解剖分离右侧颈总动脉和颈外静脉,不予处理,记为对照组。分别于术后第1周(T1)、第2周(T2)、第4周(T3)时,实验组在吻合口静脉端取一段颈外静脉,对照组在相对应位置取一段颈外静脉,采用HE染色法测算兔颈外静脉内膜厚度,采用Westernblotting法检测兔颈外静脉Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62蛋白(以荧光强度表示目的蛋白的相对表达量)。结果 实验组T1、T2、T3时兔颈外静脉内膜厚度分别为(28.94±2.36)、(36.71±3.64)、(67.51±6.40)μm,对照组T1、T2、T3时分别为(16.96±3.76)、(17.20±3.68)、(17.12±3.59)μm,两组同一时间点相比,P均<0.05。与对照组同一时间点相比,实验组Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的相对表达量均升高(P均<0.05),P62蛋白的相对表达量均下降(P均<0.05)。实验组内各时间点相比,Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的相对表达量在T2、T3时均上升(P均<0.05),P62蛋白的相对表达量在T2、T3时均下降(P均<0.05)。实验组兔颈外静脉内膜厚度与Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达均呈正相关(r分别为0.887、0.919,P均<0.01),与P62蛋白呈负相关(r=-0.788,P<0.01)。结论 接受AVF术的兔动静脉吻合口静脉端颈外静脉出现了内膜增生与自噬功能增强,且内膜增生与自噬功能增强呈正相关。

PEDV感染过程中TRIM5α介导的自噬对病毒复制的影响

旨在研究三结构域蛋白5α(tripartite motif protein 5α,TRIM5α)能否通过调控细胞自噬来影响猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea viru,PEDV)在非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)中的复制。利用Western blot(WB)检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达,明确PEDV感染Vero-E6细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TRIM5α在自噬模型中的表达水平。设计并合成3条TRIM5α的干扰片段并筛选干扰效率最高的干扰片段,将其转染至Vero-E6细胞,PEDV感染后48 h,通过WB检测LC3Ⅱ蛋白的表达水平;RT-qPCR检测PEDV的N、ORF3基因的表达水平,同时检测PEDV滴度变化,以明确TRIM5α对自噬和PEDV复制的影响。结果表明:PEDV成功感染Vero-E6细胞并诱导细胞自噬。WB结果显示感染24、36和48 h时,试验组的LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势,在48 h时表达量最高,且差异极显著(P<0.01),自噬被激活;RT-qPCR结果显示,TRIM5α的表达呈现上升趋势,在感染48 h时表达量最高,且差异极显著(P<0.01)。siRNA-2的干扰效果最好。干扰TRIM5α后,WB结果显示LC3Ⅱ蛋白表达量降低,自噬受到抑制,且RT-qPCR结果显示PEDV为N、ORF3基因的表达水平显著升高,病毒滴度明显上升。研究表明,TRIM5α通过促进细胞自噬抑制PEDV在Vero-E6细胞中的复制。

依达拉奉对间歇低氧损伤后大鼠脑组织自噬及凋亡的影响

目的探讨依达拉奉对间歇低氧损伤后大鼠脑组织自噬及凋亡的影响。方法采用随机数字表法将96只Wistar大鼠分为对照组、5%间歇低氧(IH)组及依达拉奉(ED)组,每组又分为1 d、3 d、7 d、14 d 4个时间点,每个时间大鼠8只。透射电镜观察大鼠海马CA1区神经细胞的超微结构;免疫组织化学法观察大鼠神经细胞自噬效应蛋白(beclin)-1、微管相关蛋白1轻链(LC)3-Ⅱ蛋白的表达;原位末端标记法记录大鼠神经细胞的凋亡情况。结果电镜下对照组神经细胞形态正常,染色质均匀,线粒体、高尔基体等细胞器结构正常;与对照组比较,5%IH组从间歇低氧损伤3 d开始逐渐出现神经元变形肿胀,核膜模糊,染色质密度欠均匀,线粒体空泡化、嵴出现断裂,激活溶酶体,出现自噬小体,随着低氧时间的延长,损伤越重;与5%IH组比较,ED组各个时间点神经元超微结构损伤减轻,自噬小体数目增多。对照组神经细胞beclin-1、LC3-Ⅱ的表达较少,各个时间点差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,5%IH组及ED组各个时间点beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达显著增多(P<0.05);与5%IH组比较,ED组各个时间点beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达显著增多(P<0.05)。对照组神经细胞凋亡较少,各个时间点细胞凋亡指数无差异(P>0.05);与对照组比较,5%IH组及ED组各个时间点细凋亡指数显著增加(P>0.05);与5%IH组比较,ED组各个时间点凋亡指数显著下降(P>0.05)。结论依达拉奉可提高早期间歇低氧大鼠神经细胞的自噬水平,进而减少神经细胞的凋亡,发挥神经保护作用。

自噬激活如何影响大鼠内皮祖细胞凋亡、增殖和周期的变化?

背景:曾有报道雷帕霉素可以对内皮祖细胞的增殖能力、迁移能力、黏附能力产生影响,但是没有提到自噬在其中所起到的不可忽视的作用,以及自噬与凋亡之间的相互关系。目的:通过雷帕霉素激活自噬探讨自噬激活对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡和周期的影响。方法:采用密度梯度离心法从骨髓获得单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上,培养7 d后收集贴壁细胞,即内皮祖细胞。加入不同质量浓度雷帕霉素(0.01,0.1,1,10μg/L)分别培养24 h。Western blot检测LC3-Ⅱ蛋白表达监测自噬的诱导情况,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期进程的变化,MTT比色法观察其增殖能力的变化,同时在透射电镜下观察其超微结构的变化。结果与结论:雷帕霉素质量浓度为0.01μg/L时,内皮祖细胞的LC3-Ⅱ蛋白表达与对照组相比并没有明显的增高,当质量浓度为0.1μg/L时LC3-Ⅱ蛋白表达处在一个较高的水平,质量浓度为1μg/L和10μg/L时LC3-Ⅱ蛋白表达虽然也高于对照组,但却明显低于0.1μg/L时,据此推断雷帕霉素在质量浓度为0.1μg/L时自噬尤为活跃。内皮祖细胞的凋亡率呈现随着雷帕霉素质量浓度的升高而增加的趋势,增殖率呈现随雷帕霉质量浓度增加而降低的趋势。结果说明雷帕霉素激活自噬后能够促进细胞的凋亡,明显改变细胞的周期进程,抑制内皮祖细胞的增殖。

扶正化瘀胶囊对气虚血瘀型肝纤维化大鼠Nrf2-Keap1-Are信号通路的影响

目的:探讨益气化瘀法调控Nrf2-Keap1-Are抗氧化应激通路对气虚血瘀型肝纤维化大鼠作用机制。方法:将30只SD大鼠,根据随机数字表法分正常组、模型组、治疗组,每组10只,除正常组外其余两组大鼠以CCl4和游泳试验行气虚血瘀型肝纤维化造模。从实验第7周开始,模型组和正常组大鼠以2 ml生理盐水灌胃,1次/d;治疗组大鼠以0.5 g/kg剂量的扶正化瘀胶囊生理盐水溶液灌胃,1次/d。均连续灌胃4周。之后处死大鼠分别测定肝重、肝湿重;采用RT-PCR法检测α-SMA、Nrf2、Keap1、β-actin mRNA表达水平,用Western blot法检测α-SMA、LC3Ⅱ、P62、Nrf2、Nqo1、GAPDH蛋白表达量。结果:模型组大鼠肝纤维化Ishak评分高于正常组和治疗组(P<0.01);模型组大鼠α-SMA mRNA表达最高,治疗组大鼠其表达量显著下降(P<0.05);模型组大鼠Nrf2、KeaP1 mRNA表达最低,治疗组大鼠其表达量显著升高(P<0.05);α-SMA、LC3II蛋白表达在模型组最高,在治疗组则显著下降(P<0.05);而P62、Nrf2、Nqo1蛋白表达在模型组最低,在治疗组则显著升高(P<0.05)。结论:气虚血瘀型肝纤维化大鼠LC3II蛋白可下调P62蛋白表达,进而抑制Nrf2-Keap1-Are抗氧化应激通路的激活,加重肝纤维化进展,通过具有益气扶正、活血化瘀作用的扶正化瘀胶囊治疗,可逆转上述过程。

高剂量西罗莫司可能通过促进细胞自噬对老年小鼠肝脏缺血-再灌注损伤起保护作用

目的探讨高剂量西罗莫司(雷帕霉素)对老年小鼠肝脏缺血-再灌注损伤(HIRI)的保护作用及其作用机制。方法 20只C57BL/6系老年小鼠按随机数字表法随机分为4组:缺血-再灌注组(IRI组)、低剂量雷帕霉素预处理组(rpm组)、高剂量雷帕霉素预处理组(RPM组)、对照组(Sham组),每组5只。Sham组仅开腹、关腹;其余3组建立老年小鼠70%HIRI模型,缺血时间均为60 min;rpm组和RPM组分别在术前1 h腹腔注射雷帕霉素1 mg/kg和5 mg/kg。再灌注12 h后,采用苏木素-伊红(HE)染色检测各组小鼠肝组织病理学变化,并采用Suzuki评分法进行病理学评分;比较各组小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平、血清肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-10水平以及肝组织中细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ蛋白水平。结果小鼠肝组织HE染色示Sham组为正常肝组织;IRI组和rpm组肝细胞损伤严重,炎症细胞大量浸润;RPM组可见肝窦轻度淤血,炎症细胞轻度浸润。病理学评分示RPM组为5(4~6)分,均低于rpm组[7(5~8)分]及IRI组[8(7~10)分](Z=-2.554、-2.731,均为P<0.05)。各组小鼠术后肝功能结果显示,RPM组AST[(691±207)U/L]显著低于IRI组[(2 032±575)U/L]、rpm组[(1 817±777)U/L](t=4.90、3.13,均为P<0.05);RPM组ALT[(996±584)U/L]均显著低于IRI组[(2 992±992)U/L]、rpm组[(2 373±687)U/L](t=3.86、3.41,均为P<0.05),而IRI组和rpm组的AST、ALT比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。各组小鼠血清中的TNF-α和IL-10水平比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。Western-blot法显示RPM组肝组织LC3B-Ⅱ蛋白的相对表达量明显高于Sham组、IRI组、rpm组(均为P<0.05)。结论高剂量雷帕霉素可能通过促进细胞自噬对老年小鼠HIRI起保护作用。

HAD及非HAD患者中枢神经系统来源的HIV-1 Nef蛋白对U87细胞自噬的影响

目的研究HIV-1 Nef蛋白氨基酸位点变异对其抑制神经细胞自噬的影响,探讨Nef蛋白致中枢神经系统损伤的机制。方法分别扩增和克隆1例HIV相关性痴呆(HIV-associated dementia,HAD)患者(H)及1例非AIDS HAD患者(N)中枢神经系统颞叶(temporal cortex,TC)部位的HIV-1 nef基因,进行序列分析,研究氨基酸位点变异;构建H-TC和N-TC来源的Nef真核表达载体p EGFP-N1-nef,并分别转染U87细胞,观察绿色荧光蛋白并初步判断Nef蛋白表达情况;同时Western blot检测U87细胞Nef蛋白及细胞自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、p62蛋白的表达,分析不同来源的Nef对U87细胞自噬的影响。结果PCR扩增并构建H-TC及N-TC nef基因克隆载体pMD-19T-nef,测序证实为HIV-1B亚型,氨基酸序列分析显示,H-TC与N-TC关键氨基酸位点存在差异;成功构建pEGFP-N1-nef重组质粒,在U87细胞内表达Nef蛋白,转染后48 h Nef蛋白表达量最高;Western blot结果分析表明,LC3-Ⅱ蛋白的表达量在组间的差异有统计学意义(F=11.764,P=0.001),两组细胞中LC3-Ⅱ含量较低,Western blot未能检测到。,空白组与空载体组之间LC3-Ⅱ的表达量差异无统计学意义(P=0.169),H-TC、N-TC及阳性对照CQ组LC3-Ⅱ表达升高,与空白对照或空载体相比,差异具有统计学意义(P=0.017,P=0.039,P=0.031),且H-TC组LC3-Ⅱ的表达量高于N-TC组(P=0.023);H-TC、N-TC及阳性对照CQ组p62蛋白的表达量较空白对照或空载体组有所升高,但组间差异无统计学意义(F=2.049,P=0.163)。结论HAD及非HAD患者中枢神经系统中HIV-1 Nef氨基酸位点存在差异,对U87细胞自噬的影响也因此不同,H-TC来源的Nef诱导自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达的能力更强。

雄激素介导的自噬对痤疮皮脂分泌的影响

目的探讨雄激素介导的自噬抑制对痤疮患者皮脂分泌的影响。方法选取2016年9月至2018年9月皮肤性病科收治的患有痤疮的女性患者共68例为观察组,行抗雄激素(炔雌醇环丙孕酮片)治疗3个月。另随机选取68名无痤疮的正常女性志愿者作对照组。检测对照组和观察组治疗前后的血清雄激素双氢睾酮(DHT)、皮脂分泌甘油三酯(TG)水平,以及用Western blot法检测自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ和P62的含量,并进行比较。结果观察组治疗前DHT水平高于对照组,治疗后DHT水平较治疗前下降,且低于对照组(P<0.01);观察组治疗前皮脂分泌TG水平高于对照组,治疗后TG水平较治疗前下降(P<0.01),接近对照组TG水平(P>0.05);观察组治疗前LC3-Ⅱ、P62含量低于对照组,治疗后LC3-Ⅱ、P62含量较治疗前升高,且高于对照组(P<0.01)。结论雄激素介导的自噬抑制对皮脂分泌有促进作用,通过抑制雄激素的分泌,可以解除一定程度的自噬抑制,减少皮脂的异常分泌。