克氏原螯虾LC3基因克隆及组织特异性表达

为了研究克氏原螯虾LC3基因的序列及其生物信息学,分离并提取肝胰腺组织,并克隆了其LC3基因ORF全长序列。结果表明,克氏原螯虾LC3基因ORF序列片段为369 bp,编码122个氨基酸。结构分析显示,LC3基因存在2个结构域,证明了LC3基因在细胞自噬中存在多种功能。序列比对及系统进化树分析表明,克氏原螯虾与节肢动物进化关系最接近,其LC3基因序列具有节肢动物的典型特征,在进化过程中保守性较高。荧光定量PCR显示,克氏原螯虾LC3基因在肝胰腺中表达水平最高,与肠道相比有显著差异(P<0.05),与心脏和肌肉无显著差异(P>0.05);心脏和肌肉中LC3基因的表达量次之,但与肠道相比差异显著(P<0.05);肠道中LC3表达量最低。该研究结果可为深入研究LC3基因表达与动物营养调控提供基础依据和参考。

自噬-溶酶体标记基因LC3B和LAMP2调控序列变异与退行性心脏瓣膜病的关联性

目的探索自噬-溶酶体标记基因LC3B和LAMP2调控序列变异与退行性心脏瓣膜病(DHVD)的关联性。方法对212例DHVD患者组与390例健康对照组的自噬-溶酶体系统标记基因LC3B和LAMP2调控序列(启动子)进行统计分析。采集研究对象的外周静脉血白细胞,提取基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增基因LC3B和LAMP2的启动子序列,Sanger测序法直接检测序列变异。运用卡方检验对单核苷酸多态性(SNPs)进行分析,TRANSFAC数据库预测序列变异改变与启动子相结合的转录因子。结果共发现29个序列变异,包含13个SNPs。其中,6个LC3B基因启动子序列变异仅发现于DHVD患者,1个LAMP2基因启动子序列变异只存在于DHVD女性患者,其他序列变异在健康对照组和患者组共有。对SNPs的基因型和等位基因进行卡方检验和logistic回归分析显示,rs35227715的等位基因G与DHVD相关联,是DHVD的独立危险因素,致病风险是1.36倍;rs42900基因型CC和等位基因C与DHVD存在关联,两者的致病风险均为0.56倍,具有保护性作用。利用TRANSFAC数据库预测仅在DHVD患者中发现的序列变异位点相结合的转录因子,结果表明序列变异可改变与之结合的转录因子。结论自噬-溶酶体系统标记基因LC3B和LAMP2启动子序列变异可能影响与之结合的转录因子,改变其表达水平,引起自噬-溶酶体系统的功能失调,从而导致DHVD的发病。

急性白血病患儿骨髓单个核细胞转铁蛋白受体、铁蛋白、Beclin1、LC3表达及意义

目的观察急性白血病患儿骨髓单个核细胞(BMMNC)中转铁蛋白受体(TfR)、铁蛋白(FN)及自噬相关基因Beclin1、LC3表达情况,并探讨其意义。方法 46例急性白血病患儿,其中急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿30例(ALL组)、急性髓细胞白血病(AML)患儿16例(AML组),另取同时期健康儿童16例(对照组)。取各组骨髓液制备BMMNC,采用逆转录PCR技术检测BMMNC中的TfR、FN、Beclin1、LC3 mRNA,采用Pearson相关分析分析TfR、FN分别与Beclin1、LC3的关系。结果 ALL组BMMNC中TfR、FN、Beclin1、LC3 mRNA的相对表达量较对照组高(P均<0.01)。AML组BMMNC中Beclin1、LC3 mRNA的相对表达量较对照组低(P均<0.01),TfR、FN mRNA的相对表达量较对照组高(P均<0.01)。在ALL组、AML组及对照组,TfR与Beclin1、LC3表达均呈负相关(P均<0.05),FN与Beclin1、LC3表达均呈正相关(P均<0.05)。结论 TfR、FN在急性白血病患儿BMMNC中表达升高;Beclin1、LC3在ALL中表达增高,而在AML中表达下降;随着自噬活性的增强,TfR表达下调、FN表达上调。

LC3Ⅱ、Beclin1在宫颈鳞状细胞癌中的表达及其与相关病理因素的关系

目的通过检测正常宫颈组织、宫颈低级别上皮内瘤变(LSIL)组织、宫颈高级别上皮内瘤变(HSIL)组织和宫颈鳞状细胞癌组织中自噬基因LC3Ⅱ和Beclin1的表达水平,分析LC3Ⅱ、Beclin1与宫颈鳞状细胞癌临床病理特征之间的关系及其相关性,探讨自噬基因在宫颈鳞状细胞癌发生、发展中的作用及其对患者生存的影响。方法选取2015年6月-2019年6月在甘肃省人民医院妇产科接受诊治且临床资料完整的宫颈标本190例,其中正常宫颈组织20例、LSIL组织30例、HSIL组织48例(CIN 22例、CINⅢ26例)、宫颈鳞状细胞癌组织92例。免疫组化染色法检测LC3Ⅱ、Beclin1的表达水平,并采用Kaplan-Meier生存曲线比较分析患者总生存期。结果 LC3Ⅱ、Beclin1阳性表达率随宫颈细胞病变级别的升高渐呈下降趋势,正常宫颈组织、LSIL和HSIL组织、宫颈鳞状细胞癌组织比较,差异有统计学意义,而正常宫颈组织和LSIL组织间差异无统计学意义。LC3Ⅱ、Beclin1在宫颈鳞状细胞癌中的表达无相关性。Beclin1、LC3Ⅱ不是影响宫颈鳞状细胞癌总生存时间的独立危险因素,但患者的生存率随着Beclin1、LC3Ⅱ阳性表达率的增高而呈增高趋势。结论 LC3Ⅱ、Beclin1在宫颈细胞癌变过程中表达逐渐下调,癌变完成后自噬能力显著降低,自噬活性的改变可能与宫颈鳞状细胞癌的发生、发展相关。

Bcl-2和LC3对膀胱癌发生发展及预后的相关性分析

目的研究膀胱尿路上皮癌细胞中Bcl-2与自噬相关基因LC3表达及生物学行为,并探讨其对膀胱癌预后的影响。方法Bcl-2 siRNA质粒转染人膀胱移行细胞癌(T24)细胞,蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链式反应检测Bcl-2和LC-3的表达,并研究Bcl-2敲降对T24细胞体外生长和凋亡的影响。在癌组织病理标本中检测Bcl-2和LC3的表达情况,进行预后分析。结果Bcl-2 siRNA重组质粒成功转染T24细胞,Bcl-2 mRNA表达下调约80%,Bcl-2蛋白表达下调约70%,LC3的mRNA和蛋白水平下调了约40%。pGenesil-1 Bcl-2 siRNA组Bcl-2和LC3蛋白表达低于NC组及空质粒组,差异有统计学意义(P<0.05)。T24细胞活力降低为(66.8±5.8)%,细胞凋亡率为56.68%。pGenesil-1 Bcl-2 siRNA组细胞活力高于空质粒组及NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。正常膀胱组织和膀胱癌中LC3表达的阳性率表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Bcl-2蛋白在正常膀胱组织及膀胱尿路上皮癌中的表达的阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。不同分级、分期的膀胱尿路上皮癌样本中LC3蛋白的表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)。有无淋巴结转移的膀胱尿路上皮癌样本中Bcl-2蛋白的表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Bcl-2基因的下调会降低膀胱癌细胞LC3的表达水平,抑制细胞生长,促进其凋亡。Bcl-2与LC3结合有助于判断膀胱尿路上皮癌的预后。

人自噬相关基因LC3B原核表达载体的构建及活性检测

目的构建带GST标签的人LC3B基因原核表达载体,得到GST-LC3B重组质粒并纯化出GST-LC3B融合蛋白,体外检测并证实该蛋白的生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出LC3B基因的编码序列,将该序列插入到p GEX-KG载体中,得到GST-LC3B重组质粒,转化大肠杆菌Rossate,经小量诱导后利用GSTSepharose 4B亲和珠纯化GST-LC3B融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western印迹方法进行检测,GST pull-down技术证实其生物学活性。结果利用PCR技术从人乳腺文库中成功扩增得到大小约400 bp的目的基因片段,插入p GEX-KG载体中得到GST-LC3B质粒,经双酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量(Mr)约为40×103的目的蛋白;GST pull-down技术检测出GST-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白在体外作用,具有较好的生物学活性。结论成功构建了人自噬相关基因LC3B的原核表达产物,为进一步研究LC3B在自噬中的作用机制奠定了基础。

苦参碱诱导肝癌HepG2细胞自噬的作用与机制

目的探讨苦参碱对肝癌HepG2细胞自噬的作用,进一步研究苦参碱诱导HepG2细胞自噬的机制。方法将0.0(对照组)、0.4、0.8、1.6g·L^(-1)苦参碱及0.4g·L~(^(-1))苦参碱+10mmol·L^(-1)自噬特异抑制剂(3-MA)分别作用于肝癌HepG2细胞,构建体外模型。采用免疫印迹法(Western blotting)检测自噬基因LC3-Ⅱ的表达,实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)检测自噬基因WIPI1的表达,Annexin V FITC-PI流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率,电镜观察HepG2细胞自噬体变化与凋亡情况。结果 0.4、0.8、1.6g·L^(-1)苦参碱作用的HepG2细胞LC3-Ⅱ表达相比对照组均显著增加(P<0.05),其中0.4g·L^(-1)苦参碱作用的HepG2细胞LC3-Ⅱ表达水平最高;0.4g·L^(-1)苦参碱作用的HepG2细胞自噬体、WIPI1mRNA表达水平较对照组明显增加(P<0.05)。0.4g·L^(-1)苦参碱联合3-MA作用的HepG2细胞凋亡率较单纯0.4g·L^(-1)苦参碱作用的凋亡率显著增加(P<0.05)。结论苦参碱诱导HepG2自噬且减少细胞凋亡,与WIPI1的表达相关。自噬抑制剂可抑制苦参碱诱导的自噬,促进肝癌细胞凋亡,二者联合可成为临床治疗肝癌的新措施。