地衣素合成酶关键模块LchAD蛋白的性质和功能研究

【目的】地衣素(lichenysin)作为一种脂肽类物质,对白酒风味形成有促进作用。为研究地衣素合成酶中硫酯酶模块LchAD蛋白的性质和功能,采用传统分离纯化方法从酿酒大曲样品中,筛选产地衣素的芽孢杆菌菌株。【方法】采用质谱串联的方式检测发酵产物,通过形态学、生理生化实验和构建系统发育树,分析菌株的种属关系。以筛选出的菌株基因组DNA为模板克隆LchAD基因,在大肠杆菌中异源表达LchAD蛋白并用镍柱纯化。利用在线软件对LchAD蛋白进行生物信息学分析,探究LchAD蛋白的性质和功能。【结果】在大曲中筛选获得的菌株YC7为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),其发酵产物中含有地衣素A(D或G)的同系物,表明菌株YC7为地衣素产生菌。LchAD蛋白的可溶性表达研究发现,在温度为20℃,IPTG终浓度为100μg/mL条件下可诱导LchAD蛋白异源表达,并形成可溶性蛋白,其分子量约为27.62 kD。镍柱纯化结果显示,在咪唑浓度为250 mmol/L时,可获得较高纯度的LchAD蛋白。生物信息学分析结果表明,LchAD蛋白为稳定的亲水性蛋白,无信号肽,理论等电点(pI)为7.23,含有一个GrsT保守结构域。LchAD蛋白的二级结构包含43.5%的α-螺旋,13.82%的β-折叠,5.69%的β-转角,其三级结构与表面活性素合成酶的硫脂酶模块相似。【结论】筛选得到的地衣芽孢杆菌YC7菌株可产地衣素,其LchAD基因编码的蛋白为27.62 kD的亲水性蛋白,异源表达获得可溶性LchAD蛋白,该蛋白可能与合成表面活性素的硫酯酶模块功能相似。

Notch家族蛋白、LCHAD在早发型重度子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义

目的探讨Notch家族蛋白、长链三羟基酰基辅酶A脱氢酶(LCHAD)的表达与早发型重度子痫前期发病的关系,揭示早发型重度子痫前期发病机理。方法选择早发型重度子痫前期患者45例、晚发型重度子痫前期患者42例为研究组,40例正常分娩者为对照组,免疫组化法检测Notch家族蛋白、LCHAD在胎盘绒毛组织中的分布和表达水平。结果各组胎盘组织的合体滋养细胞、血管内皮细胞、蜕膜细胞中均可以检测到Notch家族蛋白、LCHAD的表达。早发型重度子痫前期组Notch家族蛋白、LCHAD表达均显著低于晚发型重度子痫前期组及对照组。各组胎盘组织中Notch家族蛋白表达与LCHAD表达水平呈正相关。结论早发型重度子痫前期组胎盘中Notch家族蛋白、LCHAD低表达与疾病的发病发展密切相关。二者通过影响滋养细胞浸润,胎盘浅着床在早发型重度子痫前期发生发展中起重要作用。

长链脂肪酸氧化酶mRNA在正常妊娠及重度子痫前期胎盘中的表达

目的研究长链羟酰基辅酶A脱氢酶(long-chain3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenase,LCHAD)在正常妊娠不同孕期绒毛或胎盘组织的表达情况以及在伴有肝脏损害和不伴有肝脏损害重度子痫前期胎盘的表达差异。方法应用原位杂交和RT-PCR方法对早孕绒毛组织(10例)、妊娠中期胎盘组织(10例)、正常妊娠晚期胎盘组织(10例)及32例重度子痫前期胎盘组织进行LCHAD基因的定位表达及半定量测定。结果原位杂交实验显示正常妊娠早、中、晚期绒毛或胎盘组织及重度子痫前期胎盘组织滋养细胞中存在LCHAD阳性表达。RT-PCR实验显示①妊娠早期绒毛LCHAD表达与妊娠中期比较,P=0.844;妊娠早期绒毛LCHAD表达高于晚期胎盘,P=0.020;妊娠中期胎盘LCHAD表达也高于晚期胎盘P=0.026;②发病孕周≤34周早发型重度子痫前期伴肝损害胎盘组织中LCHAD表达均值为(0.449±0.038),不伴肝损害LCHAD表达均值为(0.482±0.042),伴肝损害较不伴肝损害者表达有减弱,但两组比较,P=0.084;发病孕周≤34周早发型重度子痫前期伴肝损害LCHAD表达量与正常晚期比较,P=0.05,而不伴肝损害重度子痫前期LCHAD表达量与正常晚期比较,P=0.775。结论本研究显示在妊娠的早中晚期滋养细胞中均存在长链脂肪酸氧化代谢,妊娠早中期LCHAD的mRNA表达高于妊娠晚期;早发型重度子痫前期伴肝损害胎盘组织中LCHAD表达均值与不伴有肝损害者比较虽无统计学差异,但是有明显降低趋势。提示长链脂肪酸氧化代谢对子痫前期伴发肝脏损害的影响还有待酶活性和蛋白水平以及代谢调节方面的深入研究。

游离脂肪酸对滋养细胞线粒体长链脂肪酸氧化酶表达的影响

目的探讨不同链长游离脂肪酸对人滋养细胞线粒体脂肪酸β氧化循环中长链三羟基酰基辅酶A脱氢酶（LCHAD）基因和蛋白表达变化的影响。方法体外无血清培养人绒毛滋养细胞，将细胞分为五组，每组用不同链长脂肪酸孵育细胞，分别为无游离脂肪酸（F-FFA）、短链脂肪酸（SC—FFA）、中链脂肪酸（MC—FFA）、长链脂肪酸（LC—FFA）、极长链脂肪酸（VLC-FFA）。采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测各组LCHAD基因和蛋白的表达变化。结果与F-FFA、SC—FFA、MC—FFA3组比较，LC—FFA组LCHAD基因和蛋白明显降低（P〈0．05），VLC—FFA组LCHAD基因明显升高（P〈0．05），而蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）。F-FFA、SC—FFA、MC—FFA3组之间LCHAD基因和蛋白表达差异无统计学意义（P〉0．05）。与LC—FFA组比较，VLC-FFA组LCHAD基因和蛋白明显升高（P〈0．05）。结论游离脂肪酸对人滋养细胞线粒体脂肪酸B氧化循环LCHAD的基因蛋白表达变化存在影响；LC—FFA刺激下的胎盘滋养细胞中存在LC-FFA线粒体β-氧化代谢障碍。VLC-FFA与脂肪酸β-氧化代谢存在一定的相关性，其相互作用机制还有待进一步研究。短链、中链脂肪酸未显示对线粒体脂肪酸β-氧化代谢的影响。

游离脂肪酸对滋养细胞线粒体脂肪酸氧化功能的影响及其与p38MAPK信号通路的相关性

目的探讨不同链长游离脂肪酸对胎盘滋养细胞中线粒体长链脂肪酸氧化功能影响及其与p38MAPK信号通路的相关性。方法分别以无游离脂肪酸和短、中、长、极长链脂肪酸孵育胎盘滋养细胞（F．FFA、SC-FFA、MC-FFA、LC-FFA、VLC-FFA组）。再分别以DMEM／F12培养基、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）抑制剂和p38MAPK抑制剂孵育细胞。采用荧光实时定量PCR（ReahimePCR）和蛋白印迹法（Westernblot）检测各组LCHAD基因和蛋白表达变化。结果（1）LCHAD的mRNA表达变化：F．FFA＋DMED、SC．FFA＋DMEM、MC-FFA＋DMEM、LC-FFA＋DMEM、LC-FFA＋NADPH-I、LC-FFA＋p38MAPK-I、VLC-FFA＋DMEM、VLC-FFA＋NADPH-I、VLC-FFA＋p38MAPK-I组LCHADmRNA的△ct值为4．57±0．12、4．36±0．09、4．55±0．10、6．84±0．42、4．45±0．24、5．08±0．36、2．23±0．15、3．90±0．32、3．81±0．40。与F-FFA各组相比较，LC-FFA＋DMEM／p38MAPK-I组LCHADmRNA相对表达量明显降低，差异有统计学意义（P〈0．05），而VLC各组均有明显升高，差异有统计学意义（P〈0．05）；与LC-FFA＋DMEM组相比较，LC-FFA＋NADPH-I／p38MAPK-I组LCHADmRNA相对表达量明显升高，差异有统计学意义（P〈0．05）；与VLC-FFA＋DMEM组相比较，VLC-FFA＋NADPH．I／p38MAPK．I组中LCHADmRNA相对表达量明显降低，差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）LCHAD蛋白表达变化：F-FFA＋DMED、SC-FFA＋D1VIE／VI、Mc-FFA＋DMEM、LC-FFA＋DMEM、LC-FFA＋NADPH-I、LC-FFA＋p38MAPK-I、VLC-FFA＋DMEM、VLC-FFA＋NADPH-I、VLC-FFA’p38MAPK-I组LCHAD／B-肌动蛋白比率分别为23．6±13．0、21．2±10．2、19．7±1．9、10．6±2．6、14．0±1．8、14．0±2．8、29．3±1.9、35．8±3．2、35．2±4．5。与F-FFA各组比较，LC-FFA组LCHAD蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P〈0．05），VLC-FFA＋NADPH-I／p38MAPK-I组LCHAD蛋白相对表达量升高，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论游离脂肪酸影响人滋养细胞线粒体脂肪酸13氧化循环LCHAD的基因蛋白表达变化；长链脂肪酸刺激下的胎盘滋养细胞中存在脂肪酸B-氧化代谢障碍，NADPH、p38MAPK抑制剂能够缓解脂肪酸氧化代谢障碍，提示p38MAPK信号通路可能参与了该过程；极长链脂肪酸与脂肪酸B-氧化代谢存在有一定的相关性，其相互作用机制还有待进一步研究。

长链游离脂肪酸对滋养细胞线粒体三羟基酰基辅酶A脱氢酶基因启动子区甲基化程度的影响

目的 探讨长链游离脂肪酸对胎盘滋养细胞线粒体β氧化循环长链三羟基酰基辅酶A脱氢酶（LCHAD）基因启动子区甲基化程度影响,以及对甲基化修饰的时间效应.方法 体外培养原代人绒毛滋养细胞及HTR-8/SVneo永久性人滋养细胞,研究组采用长链游离脂肪酸孵育滋养细胞（LC-FFA组）,并以短链游离脂肪酸（SC-FFA组）和中链游离脂肪酸（MC-FFA组）作为不同链长游离脂肪酸对照组,空白对照组无脂肪酸（F-FFA组）.分别在孵育24、48及72 h收集细胞并提取DNA.在LCHAD基因转录起始位点上游2 000 bp区域内序列预测CpG岛位置,设计甲基化检测位点和引物.采用Sequenom MassArray甲基化DNA定量分析平台检测不同组CpG岛各CpG位点的甲基化程度后进行各甲基化位点和CpG岛的统计学分析.结果 （1）在LCHAD基因转录起始位点上游2 000bp区域内的17个CpG位点中获得11个位点（65％）的甲基化程度,8个为单独位点,3个为复合位点（-984、-960、-899、-853、-811、-796、-774、-727、-615、-595、-579）.在不同研究组中每个位点的甲基化变化程度各不同,其中-899位点变化最明显.（2）LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度变化分析：①长、中链游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度影响伴随时间的延长呈现升高趋势：LC-FFA组孵育72 h（0.55±0.08）比孵育48 h（0.35±0.12）及24 h（0.31±0.04）均明显升高（P＜0.05）,48 h虽比24 h升高,但差异无统计学意义（P＞0.05）.MC-FFA组孵育72 h（0.44±0.05）比孵育24 h（0.31±0.04）明显升高（P＜0.05）.②不同链长游离脂肪酸在不同作用时间影响LCHAD基因启动子区CpG岛甲基化程度比较：LC-FFA组孵育72 h的甲基化程度比MC-FFA、SC-FFA组及F-FFA组的72、48及24 h均明显升高（P＜0.05）.（3）作用72 h游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区11个CpG位点甲基化程度影响比较：在LC-FFA组和MC-FFA组-899位点甲基化程度明显高于其他位点（P＜0.05）.（4）长链游离脂肪酸对LCHAD基因启动子区-899位点甲基化程度影响伴随时间的延长呈现升高趋势（P＜0.05）.LC-FFA组孵育72 h比MC-FFA、SC-FFA组及F-FFA组的72、48及24 h均明显升高（P＜0.05）.结论 长链游离脂肪酸比中链和短链游离脂肪酸呈现较大的滋养细胞LCHAD基因启动子区甲基化的修饰作用,并伴随作用时间延长表现出明显的时间依赖效应;甲基化程度改变主要发生在LCHAD基因启动子区-899位点.