应用磷酸化蛋白质组学方法初步研究喉癌相关基因LCRG1的功能

mRNA差异显示技术克隆的喉癌相关基因LCRG1,对不表达该基因的喉癌细胞系(Hep-2)的生长具有明显抑制作用.软件分析推测,LCRG1可能在细胞信号传导中发挥作用.为进一步地研究LCRG1的功能,应用RT-PCR和平板克隆形成实验证实,经多次传代的Hep-2/LCRG1细胞,仍表达LCRG1,且LCRG1具有显著的抑制细胞增殖的能力.抽提Hep-2/LCRG1和Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系总蛋白质,应用固相pH梯度(IPG)双向凝胶电泳(2DGE),结合抗酪氨酸磷酸化抗体的免疫印迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS),鉴定酪氨酸磷酸化的蛋白质.得到了分辨率较高、重复性较好的Hep-2/LCRG1和Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系的总蛋白质双向凝胶电泳图谱;结合免疫印迹反应、软件分析和质谱技术识别并鉴定了13个差异反应的酪氨酸磷酸化的蛋白质.这些蛋白质参与了细胞信号传导和细胞代谢等过程.推测LCRG1可能是通过调节这些蛋白质的酪氨酸磷酸化、去磷酸化状态,参与细胞增殖、代谢和凋亡等过程的调控,而发挥抑瘤作用.这为全面、真实地揭示LCRG1抑瘤作用的分子机理提供了新思路.

喉癌相关基因LCRG1蛋白的细胞亚定位及生物学特性研究

目的:研究我们实验室最近克隆的喉癌相关基因LCRG1编码蛋白的细胞亚定位以及其是否具有抑瘤功能。方法:采用绿色荧光蛋白(GFP)荧光定位的方法,研究该基因编码蛋白的细胞亚定位;通过绘制细胞生长曲线,以及运用转染细胞软琼脂集落形成试验和裸鼠致瘤试验,研究喉癌相关基因LCRG1在喉癌细胞系Hep-2中的生物学特性。结果:喉癌相关基因LCRG1编码的蛋白定位在细胞核内;将LCRG1cDNA导入到不表达该基因的喉癌细胞系Hep-2中,观察到明显的生长抑制作用,表现为抑制Hep-2细胞的停泊非依赖性生长和抑制裸鼠致瘤性。结论:喉癌相关基因LCRG1具有一定的抑瘤功能。

LCRG1基因启动子关键顺式调节元件的鉴定

LCRG1基因(laryngeal carcinoma related gene1,LCRG1)是一个新的喉癌候选抑瘤基因,其转录调控机制一直未被阐明.通过限制性内切酶酶切介导对LCRG1基因(-169～+127)区域进行剪切体分析,将LCRG1基因最小启动子定位于-169～-57.应用连接体扫描突变体分析,将关键顺式作用元件确定在-137～-122.生物信息学提示该区存在SP1、E2F1/DP1、EKLF和ZF9转录因子结合位点.利用已知反式作用因子与报告基因质粒进行共转染,提示Spl为有效的反式作用因子,且能上调LCRG1基因的表达.凝胶迁移阻滞实验确定LCRG1基因关键的顺式作用元件区域具有Spl结合位点.LCRG1基因启动子-137～-122片段在该基因表达过程中可能起重要作用,为LCRG1基因功能研究提供了新的证据.

人LCRG1基因启动子的鉴定与初步分析

Laryngeal carcinoma related gene 1(LCRG1)是一个喉癌候选抑瘤基因,为进一步深入研究其转录调控机制,应用5′RACE技术确定了该基因的转录起始位点,然后在对人LCRG1基因进行生物信息学分析的基础上,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了11种含不同长度LCRG1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,-169～+127区域的启动子活性最高.研究提示,LCRG1基因转录所必需的基因启动子序列在-169～+127范围内.

miR-181d靶向LCRG1调控喉癌细胞Hep2增殖与迁移的机制

目的探讨miR-181d对LCRG1的调控作用及miR-181d对喉癌Hep2细胞增殖的影响。方法利用基因芯片和RTPCR技术检测miR-181d在喉癌组织和癌旁组织中的表达;生物信息学预测喉癌候选抑瘤基因LCRG1的靶标miRNAs;构建LCRG1 3'UTR荧光素酶载体,双荧光素酶检测系统测定其荧光素酶活性;将miR-181d mimic和miR-181d inhibitor瞬转入Hep2细胞,RT-PCR结果验证miR-181d的表达后,再用Western blot法检测各组中LCRG1蛋白的表达;采用MTT实验、迁移、侵袭及流式细胞术等实验,观察转染组与对照组细胞的增殖。结果 miR-181d在喉癌组织中的表达量较癌旁组织明显升高(P=0. 046 5);miR-181d可能靶向结合LCRG1,且LCRG1蛋白表达与miR-181d表达呈负相关;下调miR-181d能降低Hep2细胞的增殖、迁移、侵袭能力,并使细胞周期主要阻滞于G1期。结论在Hep2细胞中miR-181d可以结合LCRG1 3'UTR,负性调控LCRG1的表达并使Hep2细胞增殖、迁移和侵袭能力增强。

Sp1和Egr-1对LCRG1基因启动子转录活性的调节研究

目的:目前LCRG1基因转录调控机制不清,现拟研究Sp1和Egr-1对人LCRG1基因启动子的转录调节。方法:利用MatInspector软件分析LCRG1基因启动子区域内潜在的转录因子结合位点,Sp1、wtEgr-1、mtEgr-1真核表达质粒与LCRG1启动子重组质粒的共转染实验,分析其对LCRG1启动子活性的影响。结果:生物信息学提示LCRG1基因启动子区域存在Sp1和Egr-1等位点,外源性突变型转录因子Egr-1能上调LCRG1基因启动子的活性。结论:突变型转录因子Egr-1可能参与该基因的表达调控。

转染LCRG1基因的喉癌细胞差异蛋白质分析

背景与目的:LCRG1基因是我室利用mRNA差异显示技术克隆的一个喉癌相关抑癌基因。先前的研究显示将LCRG1转染喉癌细胞系Hep-2,发现其具有抑制细胞增殖、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤能力的作用。本研究旨在利用比较蛋白质组学的方法筛选LCRG1抑瘤作用相关的蛋白质。方法:抽提稳定高表达LCRG1基因的Hep-2/LCRG1和载体对照组Hep-2/pcDNA3.1(+)的细胞总蛋白,采用双向凝胶电泳技术分别分离其总蛋白。考马斯亮蓝染色显色,PDQuest图像分析系统分析获取的2-D胶图像,从胶中选取差异表达的蛋白质点,进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱或电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱分析,最后Mascot软件搜索数据库初步鉴定蛋白质。结果:获得了重复性和分辨率较好的Hep-2/LCRG1和Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系的双向凝胶电泳图谱,总蛋白质点数分别为1075±43和1027±23,平均匹配率为91%。图像分析差异蛋白质点,质谱鉴定了20个差异表达的蛋白质点,其中MALDI-TOF-MS鉴定了16个,ESI-Q-TOFMS/MS鉴定了4个。对这些初步鉴定的差异蛋白质进行功能分析,发现一些与细胞代谢、转录调控相关的蛋白质。结论:建立了稳定高表达LCRG1基因的Hep-2/LCRG1和载体对照组Hep-2/pcDNA3.1(+)细胞系的双向凝胶电泳图谱,应用质谱技术识别并鉴定出一些与LCRG1抑瘤作用相关的差异表达蛋白质,为进一步研究LCRG1作用的分子机制提供新的线索。

筛选喉癌相关基因LCRG1的有效沉寂序列

目的:拟采用RNA干扰技术筛选有效的针对LCRG1基因的打靶序列。方法:首先采用PCR定点突变技术改造pSuper载体,而后利用该改造后的载体构建针对LCRG1基因的5对打靶序列的真核表达载体。将构建的重组pSuper362,398,432,789,903表达载体和pSuper空白载体分别转染He-la细胞,经抗性药物筛选获得抗性细胞克隆和池克隆;通过RT-PCR及荧光定量PCR鉴定阳性克隆,进行平板克隆集落形成试验,以检测打靶序列沉寂LCRG1基因mRNA表达水平的效果。结果:应用PCR定点突变技术改造的pSuper载体,可被BglⅡ酶切;利用RT-PCR和荧光定量PCR检测各重组载体转染细胞池克隆LCRG1mRNA的表达发现,362组,398组,432组的基因均能封闭内源性LCRG1基因表达,尤以362组为显著;鉴定362组筛选的各个抗性克隆,发现A2和A5克隆的LCRG1mRNA表达水平明显降低。平板克隆实验结果提示362组的A2,A5和池克隆的细胞增殖能力明显强于载体和空白对照组(P<0.05)。结论:成功改建了pSuper真核表达载体;362siRNA相对其他siRNA具有较好的打靶效果,这对于应用RNAi方法研究LCRG1基因的功能和其作用分子机制具有重要的指导意义。

喉癌组织中LCRG1的表达及其临床意义

目的探讨喉癌相关基因1(laryngeal cancer related gene 1,LCRG1)在喉鳞状细胞癌(laryngeal squmous cell carcinoma,LSCC)中的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用免疫组化SP法对89例LSCC、31例喉上皮内瘤变及10例喉部息肉进行检测,观察LCRG1蛋白的表达。分析LCRG1的表达与LSCC患者性别、年龄、临床分型、组织学类型、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移的关系。结果LCRG1在LSCC中的阳性率为78.65%,低于上皮内瘤变组织和喉部息肉组织(P<0.05),随着组织分化程度的增高,阳性率明显增高(P<0.05);与患者性别、年龄、临床分型、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移无关。结论LCRG1蛋白在喉癌中表达的降低可能与癌变的发生有关,其表达与组织学分级相关。

LCRG1 SUPPRESSES TUMOR GROWTH IN VIVO BY LIPOSOME-MEDIATED GENE TRANSFER

Objective: To investigate whether LCRG1 (Laryngeal Carcinoma Related Gene 1) has tumor suppressor function. Methods: The recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/LCRG1 was successfully constructed. The biological effects of LCRG1 on Hep-2 cell line were studied by cell transfection, cell growth observation colony formation analysis and tumorigenicity experiments. Results: The LCRG1 gene potently inhibited tumorgenesis in vitro and in vivo, as showed by dramatic growth arrest observed in cell growth analysis and suppression of anchorage-independent growth and tumorigenicity in nude mice. Conclusion: Our results suggested that LCRG1 may be a candidate of tumor suppressor gene.

LCRG1基因5′端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚,本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列,寻找与其表达有关的调控序列。方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～+585bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3basic载体中。与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～+585bp)片段,测序正确;pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3basic的35倍。结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～+585bp),该片段具有启动子活性。

miR-1264对喉癌Hep2细胞增殖和迁移的影响

目的 miR-1264在喉癌中表达下调。文中旨在研究miR-1264对喉癌Hep2细胞生物学功能的影响及是否参与下调LCRG1基因的表达。方法 Real-time quantitative PCR检测miR-1264在人喉癌组织中的表达情况;将转染mimic/inhibitor NC Hep2细胞设为对照组,将未转染Hep2细胞设为空白组,将转染miR-1264 mimic/inhibitor设为实验组。利用MTT、Transwell分别观察miR-1264对Hep2细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;luciferase实验验证miR-1264和LCRG1 3'UTR的结合;RT-PCR、Western blot分别检测miR-1264、LCRG1蛋白表达。结果与对照组和空白组相比,Hep2细胞瞬转miR-1264mimic后,活细胞数量明显增加,增殖能力显著增强(P<0.05);而瞬转miR-1264 inhibitor后,活细胞数量明显降低,增殖能力减弱(P<0.05)。与对照组[(80.80±1.07)个]及空白组[(73.60±1.44)个]迁移细胞数量相比,实验组[(97.00±1.41)个]明显增加(P<0.05),迁移能力亦显著增强(P<0.05);与对照组[(80.00±1.11)个]及空白组[(73.60±1.44)个]迁移细胞数量相比,miR-1264 inhibitor组[(71.40±1.21)个]明显降低(P<0.05),迁移能力亦减弱(P<0.05)。与对照组[(43.00±1.41)个]和空白组[(50.60±1.03)个]侵袭细胞数量相比,实验组[(57.00±1.00)个]明显增加(P<0.05),侵袭能力亦显著增强(P<0.05);与对照组[(61.20±1.50)个]和空白组[(50.60±1.03)个]侵袭细胞数量相比,实验组[(27.60±0.93)个]明显降低,侵袭能力受到显著抑制(P<0.05),利用RT-PCR验证瞬转成功后,进一步应用Western blot实验检测LCRG1蛋白表达结果,显示:实验组LCRG1蛋白表达较NC对照组和空白组均无明显差异(P>0.05)。结论 miR-1264在喉癌组织中高表达,miR-1264可能不参与LCRG1蛋白的表达下调,但能增强Hep2细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

ZNF403,一个新的细胞周期调节因子的功能研究(英文)

ZNF403和LCRG1是人类基因ZNF403的2个不同转录剪切本.以往的研究表明LCRG1在喉癌细胞株Hep-2中具有抑瘤特性.本研究旨在探明ZNF403和LCRG1不同剪切本之间的关系以及在肿瘤细胞中对ZNF403的功能进行研究.首先,采用实时荧光定量PCR对这2个转录本的相对表达水平进行分析,结果表明,ZNF403表达水平在不同细胞株中明显高于LCRG1(>10倍),为该基因的主要转录表达产物.随后分别采用MTT细胞生长分析法和裸鼠体内成瘤实验在体外和体内对ZNF403的功能进行分析,结果显示ZNF403的基因沉默可以同时在体内和体外抑制喉癌细胞Hep-2细胞的生长.为了探明其作用机制,本研究还采用细胞信息学、流式细胞周期分析术和高通量PCR点阵分析方法进一步分析,结果表明,ZNF403的基因沉默可显著抑制细胞DNA的复制并延缓细胞周期进入到有丝分裂期.同时发现ZNF403可调节一系列的细胞周期调节蛋白如MCM2、p21、ATM、MRE11A等.综上研究提示ZNF403为一新的细胞周期调节因子,其功能的缺失与肿瘤发生发展密切相关.