LDHA Ki67蛋白在鼻咽癌中的表达及其意义

目的探讨乳酸脱氢酶A(LDHA)蛋白、Ki67蛋白在鼻咽癌组织中的表达及其意义。方法选取鼻咽癌黏膜组织93例(病例组)和鼻咽部慢性炎症黏膜组织30例(对照组),采用免疫组织化学检测2组标本中的LDHA蛋白、Ki67蛋白表达水平,并分析LDHA蛋白、Ki67蛋白与鼻咽癌发生、发展的关系。结果病例组的LDHA蛋白与Ki67蛋白阳性表达率分别是77.42%与72.04%,均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者病灶组织中LDHA蛋白与Ki67蛋白阳性表达率分别是83.58%与79.10%,均高于Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者,差异有统计学意义(P<0.05);发生淋巴结转移的鼻咽癌患者病灶组织中的LDHA蛋白与Ki67蛋白阳性表达率分别是84.42%与77.92%,均高于未发生淋巴结转移的鼻咽癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)。经Spearman相关分析,LDHA蛋白表达与Ki67蛋白表达呈正相关(P<0.05)。结论鼻咽癌组织中LDHA蛋白与Ki67蛋白与鼻咽癌肿瘤的发生、发展密切相关,并且在鼻咽癌的发生、发展以及淋巴结转移中起协同作用,对鼻咽癌的早期诊断及其预后判断可提供一定的参考。

黄胸鼠Ldha基因的克隆、原核表达及酶学性质研究

Ldha基因表达可生成参与糖代谢的乳酸脱氢酶(LDH),通过克隆黄胸鼠Rattus tanezumi的Ldha基因并进行原核表达后可以研究其酶学性质。以黄胸鼠骨骼肌cDNA为模板,通过RT-PCR技术获得黄胸鼠Ldha基因编码序列,进行生物信息学分析后构建pET28α-Ldha重组表达质粒,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达,采用SDS-PAGE和Western Blot对表达蛋白进行鉴定,最后检测表达蛋白的酶学性质。结果显示,黄胸鼠Ldha基因编码区序列被成功克隆,纯化后的原核表达蛋白分子量约为37 kD,Western Blot证实后,分别以丙酮酸和乳酸为底物测得酶的平均比活性为113.760 U·mg^(-1)±1.463 U·mg^(-1)和2.180 U·mg^(-1)±0.125 U·mg^(-1),琼脂糖凝胶电泳同工酶谱分析显示该蛋白具有LDH活性且仅形成1条同工酶带。在pH7.0,25℃条件下,LDHA蛋白对丙酮酸、NADH、乳酸、NAD+4种底物的平均Km值分别为0.170 mmol·L^(-1)±0.193 mmol·L^(-1)、0.088 mmol·L^(-1)±0.008 mmol·L^(-1)、22.540 mmol·L^(-1)±0.007 mmol·L^(-1)、0.413 mmol·L^(-1)±0.069 mmol·L^(-1)。黄胸鼠Ldha基因编码序列被首次克隆并表达出具有活性的酶蛋白,分析了其酶学性质,可为后续研究啮齿类动物LDH的结构和功能提供基础资料。

羟喜树碱对前列腺癌PC-3细胞能量代谢的影响

目的研究羟喜树碱对人前列腺癌PC-3细胞增殖抑制作用及能量代谢和关键酶的影响。方法选取PC-3细胞,采用MTT法测定1.0、2.0及5.0μmol/L的羟喜树碱处理该细胞24 h后细胞的增殖抑制能力。采用分光光度法测定葡萄糖摄取量及乳酸生成量及ATP生成相关能量代谢参数。采用Western blot法测定乳酸脱氢酶A(LDHA)和AMP活化蛋白激酶(AMPK)表达。结果 1.0、2.0及5.0μmol/L的羟喜树碱可抑制PC-3细胞的增殖并呈剂量依赖性(P<0.05,P<0.01),IC_(50)值为3.24μmol/L。与对照组相比,不同浓度的羟喜树碱可降低葡萄糖摄取,抑制乳酸生成及ATP生成,且均呈剂量依赖性(P<0.05,P<0.01);Western blot结果显示,不同浓度的羟喜树碱可使PC-3细胞中LDHA及AMPK表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论羟喜树碱通过可降低PC-3细胞中LDHA及AMPK表达,抑制肿瘤的有氧酵解并抑制细胞增殖。

人乳酸脱氢酶A基因的原核表达及其蛋白的纯化

目的构建带有His标签的人乳酸脱氢酶A(LDHA)基因原核表达载体,并进行蛋白纯化,为研究LDHA蛋白功能奠定基础。方法以人乳腺文库作为模板,通过PCR技术扩增得到LDHA基因的编码序列,插入到pET-28a(+)载体中并测序。LDHA在大肠杆菌中进行诱导表达并纯化蛋白,SDS-PAGE及Western印迹检测蛋白纯化效果。采用His pull-down技术检测纯化蛋白与沉默信息调节因子2(SIRT2)的相互作用。结果PCR扩增获得长度约1000 bp的LDHA编码序列,并插入到pET-28a(+)载体中,序列测定结果显示重组质粒构建成功。SDS-PAGE及Western印迹结果显示获得带有His标签的LDHA蛋白。His pull-down实验证明His-LDHA能与SIRT2体外结合,证实其生物学活性良好。结论成功构建带His标签的LDHA基因原核表达载体,并得到纯化蛋白,为进一步研究LDHA蛋白的功能奠定了基础。